Conception d'une nouvelle puce microfluidique intégrée pour la séparation continue des cellules tumorales circulantes des cellules sanguines périphériques

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17016 (2022) Citer cet article

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Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. La présentation tardive, le diagnostic inaccessible et le traitement sont des défis courants dans les pays développés. La détection et le dénombrement des cellules tumorales circulantes (CTC) le plus tôt possible peuvent conduire à un traitement plus efficace. L'isolement du CTC à un stade précoce est difficile en raison de la faible probabilité de sa présence dans le sang périphérique. Dans cette étude, nous proposons un nouveau dispositif de séparation CTC en deux étapes, sans étiquette, rapide et continu basé sur la focalisation inertielle hydrodynamique et la séparation diélectrophorétique. La dominance et le différentiel de la force de portance inertielle induite par la paroi et de la force de traînée de Dean à l'intérieur d'un canal microfluidique incurvé entraînent une séparation basée sur la taille des globules rouges (RBC) et des plaquettes (taille entre 2 et 4 µm) du CTC et des leucocytes (9– 12,2 µm). Un modèle numérique a été utilisé pour étudier le mécanisme de focalisation inertielle hydrodynamique dans un microcanal curviligne. Des simulations ont été effectuées avec les globules rouges, les plaquettes, les CTC et les leucocytes (quatre sous-types principaux) pour sélectionner la valeur optimisée des paramètres dans la conception proposée. Dans la première étape, le comportement de focalisation des cellules à l'échelle microscopique a été étudié pour trier les leucocytes et les CTC des globules rouges et des plaquettes, tandis que les CTC viables ont été séparés des leucocytes en fonction de leurs propriétés électriques inhérentes à l'aide de la diélectrophorèse dans la deuxième étape. La conception proposée de l'appareil a été évaluée pour l'efficacité de séparation des CTC à l'aide de simulations numériques. Cette étude a examiné l'influence de facteurs critiques tels que le rapport d'aspect, la force diélectrophorétique, la taille du canal, le débit, l'efficacité de la séparation et la forme sur la séparation des cellules. Les résultats montrent que le dispositif proposé produit un CTC viable avec une efficacité d'isolation de 99,5 % avec un débit de 12,2 ml/h.

Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS) et l'Observatoire mondial du cancer, le nombre de nouveaux cas de cancer par an devrait passer à 29,5 millions et le nombre de décès liés au cancer à 16,4 millions d'ici 20401,2. La plupart du temps, le cancer n'est pas diagnostiqué et traité tant que les cellules tumorales n'ont pas métastasé dans tout le corps3. Par la suite, le patient rechute peu de temps avec un très faible taux de survie. Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont les cellules qui se détachent des tumeurs primaires, des récidives ou des métastases, et circulent dans le sang périphérique, et possèdent des caractéristiques antigéniques et génétiques spécifiques à la tumeur4. Les CTC peuvent donner lieu à une croissance secondaire de tumeurs à d'autres endroits du corps appelées métastases4. Les CTC ont des caractéristiques morphologiques et moléculaires distinctes ; ils commencent à apparaître dans le sang total à un stade très précoce du développement tumoral5. Il a été constaté que le diagnostic de la maladie, la surveillance et le traitement personnalisé du cancer peuvent être effectués en tenant un compte des CTC6. Considérant le fait, il est essentiel de détecter et d'évaluer les CTC rares (un marqueur non invasif) pour diagnostiquer la maladie suffisamment tôt pour un traitement efficace7. Le dénombrement des CTC à partir du sang total est très difficile en raison de leur rareté chez les patients aux premiers stades du cancer, c'est-à-dire 1 à 10 cellules/ml8 par rapport aux autres cellules 5 × 109/ml de globules rouges, 2 × 108/ml de plaquettes et 1 × 106 leucocytes9. Des CTC viables sont nécessaires pour une analyse plus poussée du génotype et du phénotype en aval afin de déterminer la progression du cancer. La morphologie hétérogène des cellules cancéreuses rend leur isolement techniquement difficile10. Un dispositif de tri cellulaire à haute sensibilité est nécessaire pour caractériser et isoler les CTC viables. La détection de CTC à partir de sang total, souvent appelée "biopsie liquide", a attiré l'attention de la communauté scientifique et clinique11, car cette méthode a un potentiel de diagnostic, de pronostic et d'évaluation de l'efficacité du traitement12. À ce jour, plusieurs méthodes ont été conçues pour la détection et l'isolement des CTC13,14,15,16,17,18,19,20. Les techniques d'isolement exploitent les propriétés biophysiques des CTC qui les distinguent du sang total. Les trieurs de cellules microfluidiques sont les plus couramment utilisés à des fins de diagnostic. La technologie microfluidique est utilisée pour étudier les processus de transport de fluide dans les microcanaux. Ses avantages incluent une petite taille d'échantillon, un temps de réaction court et un faible coût. Des dispositifs de laboratoire sur puce (LOC) avec des fonctions intégrées basées sur la même technologie ont été développés pour effectuer des analyses biologiques21,22,23. Les trieurs de cellules microfluidiques sont généralement classés comme actifs ou passifs. Les techniques actives utilisent des stimulations externes telles qu'électriques, magnétiques, optiques, acoustiques et biochimiques, etc.22. Dans les techniques passives, aucune force externe n'est appliquée, elles utilisent plutôt des propriétés intrinsèques telles que la taille, la forme, l'architecture des canaux et les forces hydrodynamiques23. Certaines techniques nécessitent l'étiquetage des CTC avant la séparation24,25. Les échantillons sont marqués à l'aide de certains marqueurs de surface cellulaire, par exemple le marquage fluorescent, la pré-coloration, la fixation, etc., pour permettre le dénombrement et la visualisation après la séparation. Les chercheurs se sont concentrés sur le développement de méthodes de dénombrement et de détection des CTC, y compris le système CellSearch. Des efforts importants ont été faits en utilisant des techniques d'immunomarquage spécifiques aux cellules épithéliales, par exemple EpCAM ou diverses cytokératines. Cependant, ils ont un risque de perdre les CTC qui n'expriment pas EpCAM ou qui ont subi une transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT)4,26,27.

Les méthodes de séparation par inertie passive offrent un haut débit, une séparation sans étiquette avec des conceptions simples et robustes28, ce qui les rend plus prometteuses. Dans la microfluidique inertielle, les changements géométriques, par exemple les géométries curvilignes et le réseau de contraction-expansion (CEA), induisent un flux de Dean secondaire transversal dans les microcanaux pour séparer les cellules en fonction de leurs attributs physiques. Cette séparation hydrodynamique utilise une filtration massive et à haut débit des cellules sanguines et peut accueillir un débit très élevé. Malgré la popularité des méthodes passives, celles-ci présentent certaines limites, par exemple, la contamination leucocytaire dans les CTC en raison du chevauchement de la taille des cellules en cas de séparation basée sur la taille29 ; la conception est généralement basée sur un échantillon en raison de différentes géométries pour différentes cellules cibles30. Les méthodes actives, en particulier la di-électrophorèse (DEP) utilisent un champ électrique externe variable et la conductivité électrique intrinsèque des cellules pour séparer les CTC. La DEP est une technique active qui sépare les cellules en fonction de leur taille et de leurs propriétés électriques. La force DEP fait référence à la force exercée sur le moment dipolaire induit d'une particule diélectrique et/ou conductrice par un champ électrique non uniforme31,32,33. Les cellules sanguines périphériques normales et les CTC de tous les types de cancers et de tumeurs solides présentent des différences diélectriques constantes lorsqu'elles sont exposées à des champs électriques variables17,19,34,35. Par conséquent, le DEP peut isoler avec précision les CTC d'un plus large éventail de cellules. Cet isolement ne nécessite aucun protocole de marquage de surface cellulaire. Étant donné que les CTC isolés ne sont pas modifiés ou viables, ils peuvent être utilisés pour la caractérisation moléculaire afin de déterminer la progression du cancer, ce qui aide généralement à développer une thérapie personnalisée plus efficace. Profitant de la différence de propriétés électriques entre le CTC et d'autres cellules sanguines, certains trieurs à base de DEP ont été utilisés dans la détection de cellules tumorales de différents types tels que les carcinomes colorectaux, du sein, de la prostate et du poumon. La plupart des techniques basées sur le DEP utilisaient des échantillons binaires dopés et non le sang total36,37,38,39. La préparation des échantillons pour ces dispositifs est assez lourde et compliquée, tandis que d'un autre côté, la manipulation du sang total est également assez difficile. Bien que la technique DEP présente une isolation CTC précise, il existe cependant certaines limitations comme un faible débit40 et une efficacité de séparation réduite pour la microfluidique DEP à base de puce en raison de la conductivité élevée du sang41. De plus, le DEP entraîne un échauffement à l'intérieur de l'appareil, ce qui entraîne une modification des propriétés électriques de la cellule et des dommages cellulaires42.

Compte tenu des limites et avantages individuels des techniques actives et passives, des dispositifs microfluidiques hybrides ont été proposés. L'introduction de forces multiples en combinant des méthodes actives et/ou passives a permis d'obtenir une pureté élevée, une sensibilité élevée des cellules séparées et une plage de fonctionnement accrue des dispositifs tout en surmontant les limites des deux techniques22. Dans la littérature ouverte disponible, de nombreux chercheurs ont combiné le DEP avec de nombreuses méthodes actives et/ou passives pour améliorer l'efficacité de l'isolement du CTC. Le DEP a également été utilisé parallèlement à d'autres techniques actives, par exemple magnétophorétique, acoustophorétique, optophorétique. Au début, le DEP a été combiné avec le fractionnement par flux de champ (FFF) dans lequel l'équilibre cellulaire est atteint en utilisant les forces hydrodynamiques et DEP. Les cellules sont séparées en fonction de leurs densités et propriétés diélectriques et les propriétés physiques dynamiques des cellules tumorales ont été mesurées43.

Dans une étude antérieure, Moon et ses collègues ont combiné le DEP avec la technique de fractionnement en flux à orifices multiples (MOFF) pour séparer les cellules cancéreuses du sein MCF-7 des globules rouges et des globules blancs à un débit élevé de 126 µl/min39,44. L'échantillon a été préparé à l'aide de WBC et de RBC obtenus par centrifugation de sang total et de CTC dopés. L'efficacité de séparation des CTC dans l'étude rapportée était de 75,18 % en raison de la perte de CTC lors de la séparation en série et de la contamination par les GR. Ils présentaient une configuration assez longue (environ 10 cm).

Apostream, un dispositif combinant le DEP avec une méthode de fractionnement par flux de champ passif (FFF), a utilisé des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMN) isolées à partir de 7,5 ml de sang humain normal et des cellules tumorales dopées du cancer de l'ovaire SKOV3 et des cellules MDA-MB-231 du cancer du sein dans il. La récupération moyenne rapportée des cellules tumorales à partir de ce dispositif était de 75,4 % ± 3,1 % et de 71,2 % ± 1,6 %11. Bien que la séparation ait été améliorée, le dispositif signalé présentait certains problèmes tels qu'un débit limité et une surcharge cellulaire provoquant des interactions dipôle-dipôle, un regroupement et un mélange de cellules.

Le DEP-FFF a un débit limité en raison du traitement en mode batch. Un groupe de recherche a introduit une plate-forme microfluidique à flux continu de 160 mm de long et 25 mm de large. L'échantillon a été préparé à l'aide de cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 prémarquées enrichies en PBMN. Il a une efficacité de séparation moyenne de 75 % et est capable de traiter des échantillons de 10 ml en moins d'une heure45. Cependant, la grande configuration soulève la question de savoir si le même objectif pourrait être atteint dans un agencement plus court. Un autre groupe de recherche a présenté la plate-forme couplée DEP-inertie pour la séparation des particules. Ils ont utilisé des particules de polystyrène de différentes tailles dans un canal serpentin avec un DEP négatif vertical (n-DEP). La force DEP a fait léviter les particules et leur focalisation peut être effectuée verticalement en modifiant le débit et la tension en temps réel sans qu'il soit nécessaire de reconcevoir. Ils ont rapporté une efficacité de séparation de 100 % et 96 % pour les particules de 13 µm et 5 µm respectivement46,47. Un système de séparation cellulaire intégré a été rapporté utilisant l'hydrophorèse aux côtés de DEP48. En hydrophorèse, des gradients de pression hydrodynamiques sont induits par des microstructures pour manipuler les particules en suspension. Le module d'hydrophorèse était basé sur un canal serpentin avec des microstructures et le DEP était appliqué à l'aide d'un réseau d'électrodes incliné. Le système a été testé pour séparer les cellules biaisées par les astrocytes des cellules souches neurales de souris avec un débit de 3,5 ul/min49. Il a été constaté que l'interaction cellule-cellule devient significative lorsque l'hématocrite du sang dépasse 1%50. La surcharge peut être résolue en diluant l'échantillon sanguin, mais seulement jusqu'à 1:10, car au-delà de ce rapport, le pH du sang change incitant les cellules sanguines à modifier leurs caractéristiques biologiques (membrane cellulaire)51.

La conductivité électrique du sang et son taux d'hémoglobine ont une relation directe52. Si l'hémoglobine est séparée du sang total, cela réduira la surcharge cellulaire et l'échauffement par joule. Par conséquent, nous émettons l'hypothèse que si les globules rouges, contenant de l'hémoglobine, étaient séparés du sang total, cela réduirait la conductivité, la surcharge cellulaire et le chauffage par joule lors de la séparation DEP de l'échantillon restant. La séparation précoce des globules rouges et des plaquettes de l'échantillon contournera le problème d'interaction cellule-cellule car le niveau d'hématocrite baissera. Cela pourrait également réduire le temps de traitement de l'isolation CTC. De plus, une exposition plus longue au champ électrique provoque également un stress dans les cellules qui peut être réduit par un pré-enrichissement en CTC et WBC à partir d'autres cellules sanguines telles que les globules rouges et les plaquettes. Cela peut être fait en ajoutant une étape de prétraitement au trieur DEP sur une seule plate-forme. Les techniques existantes utilisent une plate-forme de centrifugation pour le pré-enrichissement avant le tri par DEP. Cependant, des études antérieures ont rapporté une perte de cellules due à la cytotoxicité causée par la rotation53. De plus, le retard de la centrifugation entraîne le mélange du sang avec le milieu à gradient. La centrifugation à grande vitesse stresse les cellules, activant et altérant ainsi l'expression des protéines et des gènes des leucocytes54. De même, le tri magnétique de l'échantillon de sang pour éliminer les globules rouges module l'expression des protéines de surface de nombreux cancers, en particulier ceux provenant des tissus épithéliaux, rendant l'isolement difficile en raison de la modification des antigènes de surface55,56. En microfluidique inertielle, les paramètres qui contrôlent le flux secondaire sont le nombre de Reynolds Re, le nombre de Dean K et le rapport d'aspect du canal AR57. Ainsi, divers dispositifs d'efficacité et de sortie souhaitées peuvent être développés en manipulant ces paramètres. Il est généralement admis qu'un instrument doit effectuer une analyse des CTC pour une procédure cliniquement pertinente pour un échantillon en deux heures58,59. Nous émettons l'hypothèse qu'avec une combinaison de ces géométries et la manipulation du flux de Dean, la configuration pourrait être plus courte et le processus de séparation se déroulerait en relativement moins de temps. En raison de la rareté des CTC et des complications liées à la manipulation des échantillons de sang périphérique, la majorité des chercheurs utilisent des échantillons binaires ou dopés pour tester leurs dispositifs proposés. Une telle pratique pourrait ne pas être valable par rapport aux résultats de l'échantillon de sang total.

Dans cet article de recherche, tous les problèmes mentionnés ci-dessus, notamment la surcharge cellulaire, l'interaction cellule-cellule, le chauffage par effet Joule, la modulation de l'expression des protéines de surface, la perte de cellules et le temps de traitement, ont été résolus à l'aide d'un autre mécanisme de séparation intégré au DEP dans un environnement microfluidique. Nous proposons ici un nouveau dispositif microfluidique intégré en série à deux étages pour séparer les globules rouges et les plaquettes du sang total à l'aide de la focalisation inertielle, puis les CTC seront isolés des leucocytes à l'aide de DEP. La méthode hybride proposée prend du sang périphérique comme entrée. L'appareil a été conçu pour réduire la surcharge des cellules, augmenter le débit et la pureté car il combine les avantages de plusieurs méthodes. L'ajout d'une autre étape élimine le risque de perte d'échantillon et a amélioré l'efficacité de l'isolement par rapport aux méthodes existantes. Cette étude vise à concevoir un dispositif microfluidique pour la détection des cellules tumorales de glioblastome (GBM). Les cellules GBM habitent la région normale du cerveau par diffusion et l'échec de la détection entraîne une incurabilité chirurgicale et le patient succombe dans les 14,2 mois60. Dans la littérature ouverte, un tel dispositif DEP hybride pour l'isolement des cellules GBM n'a pas été discuté.

Le reste de cet article est organisé comme suit : la section II explique le concept et la conception du dispositif proposé, les détails de modélisation et de simulation sont fournis dans la section III. Les principaux résultats, la discussion connexe et l'optimisation des paramètres de conception sont présentés dans la section IV. Les conclusions se trouvent dans la section V.

La conception proposée consiste en un canal de focalisation inertiel curviligne combiné intégré en série (étage passif) et un canal de tri DEP (étage actif). Le premier étage comporte deux entrées, une pour l'injection de l'échantillon et l'autre pour le flux de focalisation, c'est-à-dire la solution tampon. L'échantillon et le tampon injectés suivent la géométrie combinée conçue jusqu'à la région de bifurcation d'où les CTC et les leucocytes séparés sont livrés au deuxième étage tandis que les globules rouges et les plaquettes s'accumulent dans la sortie des déchets. L'entrée du deuxième étage est configurée symétriquement avec la sortie du premier étage pour maintenir les conditions de champ d'écoulement continu. La deuxième étape isole sélectivement les cellules hGBM via DEP. Le deuxième étage comprend deux entrées, un jeu d'électrodes et deux sorties. La première entrée de cet étage est reliée à la sortie du premier étage de sorte que les cellules séparées deviennent l'entrée du deuxième étage. Une autre entrée est destinée à l'injection d'un tampon. Une sortie est pour la collecte des CTC et l'autre pour les WBC (sortie des déchets). La figure 1 présente le dispositif microfluidique avec un étage passif intégré et un étage actif.

La représentation schématique 3D du dispositif développé avec les deux étages intégrés. Une fois que l'échantillon de sang est introduit par l'entrée, la plupart des cellules sanguines, y compris les globules rouges, les plaquettes, les lymphocytes T et les lymphocytes B, sont séparées lors de l'étape de focalisation inertielle et de la deuxième étape. Enfin, les rares cellules tumorales circulantes sont sélectivement séparées à l'aide de DEP et collectées via la sortie-II. Les globules blancs résiduels sortent par la sortie des déchets-III.

Lorsque le fluide pénètre dans la région rectangulaire de contraction incurvée, les particules qu'il contient subissent des forces de portance inertielles et une force de traînée de Dean. La direction et l'ampleur de la migration des particules dépendent de la taille de la particule et de l'équilibre entre ces forces. Étant donné que la largeur du canal est supérieure à la hauteur, un taux de cisaillement élevé est induit entre les parties supérieure et inférieure par rapport aux parois latérales. Il en résulte un mouvement des particules vers les parties supérieure et inférieure du canal en raison de fortes forces de portance inertielle. Par conséquent, en modifiant le rapport d'aspect du canal, une séparation inertielle basée sur la taille peut être effectuée en raison de la modification du taux de cisaillement et donc de la force de portance inertielle.

Les écoulements inertiels de focalisation sont régis par trois forces majeures : une force induite par la paroi, une force de portance à gradient de cisaillement et une force de traînée d'écoulement secondaire. Une cellule s'écoulant à travers un microcanal interagira avec ses parois, ce qui la fera (a) se déplacer plus lentement que le fluide, et (b) créera une pression entre la cellule et la paroi qui développera une force dirigée à l'opposé de la paroi du canal. Cette force est inversement proportionnelle à la distance entre la particule et la paroi du canal. L'éq. 1 décrit la force de portance induite par le mur61 comme :

où v est le rapport de la densité du fluide ρ à la viscosité du fluide µ, r est le rayon des particules, D est la distance entre les parois du canal, s est la distance non dimensionnée entre la particule et la paroi de référence, d/D de sorte que 0 < s < 1 pour les particules dans le canal, D1 et D2 sont des fonctions de la distance de paroi non dimensionnée s, n est la normale à la paroi au point le plus proche sur la paroi de référence, I est la matrice d'identité et v est la vitesse du fluide.

Comme le profil de vitesse microfluidique typique est parabolique, une cellule sera donc exposée simultanément à des vitesses de différentes grandeurs, ce qui amène le fluide à induire une force sur la cellule dans le sens d'un cisaillement croissant, c'est-à-dire la paroi du canal. Cette force est présentée dans l'Eq. 2.

où C est constant, \(D_{h} = \frac{2wh}{{w + h}}\) est le diamètre hydraulique (w est la largeur de la région d'expansion et h est la hauteur du canal microfluidique), vm est le vitesse maximale du canal. Cette équation montre que cette force dépend du nombre de Reynolds des canaux et de la position des particules mais est indépendante de la rotation des particules. Cette force de portance du gradient de cisaillement utilisée dans la simulation est fournie par62. En supposant que le nombre de Reynolds des particules < 1 et le flux parabolique, l'amplitude totale de ces forces de portance est fournie par Evgeny63

où \(G\) est le taux de cisaillement local et \(f_{L}\) est défini comme le coefficient de portance. Cette fonction dépend de la position des particules dans le canal et du nombre de Reynolds du canal. Quant aux écoulements secondaires, ils permettent de contrôler le nombre de positions d'équilibre au sein d'une section de canal donnée. L'équation 4 montre la force de traînée appliquée par ces écoulements secondaires. En supposant la traînée de Stokes, elle est donnée par64.

où R est le rayon de courbure du canal incurvé. Cette force de traînée est directement proportionnelle à la vitesse d'écoulement secondaire et à la taille de la cellule. Cependant, il est inversement lié au rayon de courbure de la région courbe du canal et au nombre de Reynolds du canal.

La conception proposée utilise courbe et CEA, et par conséquent les forces varient à mesure que la géométrie change. L'équilibre entre ces deux forces détermine les positions finales d'équilibre des particules. Les particules ont tendance à se localiser entre la paroi et le centre du canal sous l'effet de la portance inertielle. L'équation 3 montre que la force évolue linéairement avec le rayon de la cellule. Cela provoque le déplacement des grosses particules vers la paroi du canal. Une fois là-bas, ces cellules ne sont pas affectées par la force de traînée dean et maintiennent une distance par rapport au centre vertical du canal. Les cellules plus petites ne sont pas affectées par la force de portance inertielle et se déplacent donc vers le centre sous l'effet du flux de Dean dirigé radialement. Ainsi, les cellules sont séparées selon leur taille en sortie de canal.

Le rapport des forces de portance et de traînée cumulées \(\frac{{F_{L} }}{{F_{D} }}\) est le facteur déterminant quant à l'endroit où une cellule d'un diamètre donné s'équilibre dans le canal en identifiant ce que la force domine. Lorsque le rapport est > > 1, la focalisation inertielle des microparticules se produit tandis que lorsqu'il devient < < 1, la force de traînée dean mélange les particules65,66. L'équation 3 montre que l'intensité de la migration inertielle dépend des paramètres du système et qu'elle est directement proportionnelle à deux fois la taille de la cellule. Par conséquent, les cellules de grand diamètre ont tendance à se déplacer vers la paroi du canal et à atteindre une position d'équilibre quelque part entre la paroi et le centre. La focalisation cellule/particule par la force de portance inertielle dominante dépend fortement du rapport ap /Dh où ap est le diamètre de la cellule64,67. Dans ce rapport, le diamètre hydraulique est un facteur important en raison du changement de hauteur du canal à la même condition du nombre de Reynold. Selon l'approche et l'hypothèse que nous proposons, une séparation efficace préalable des globules rouges et des plaquettes (taille ~ 2-4 µm) du sang total pourrait faciliter l'isolement et la récupération du CTC au stade DEP. D'après les découvertes de Lee et al.68, un microcanal CEA à faible rapport d'aspect permet la séparation de particules de moins de 4 µm de diamètre à haut débit et débit. Par conséquent, nous avons opté pour un rapport d'aspect faible de la région de contraction du canal microfluidique inertiel. Compte tenu des diamètres de toutes les cellules cibles, nous avons initialement conçu différents canaux microfluidiques Curved-CEA avec un faible rapport d'aspect (AR = H/W) et une hauteur de canal allant de 40 à 100 µ. Nous avons étudié le comportement de la focalisation cellulaire en explorant quantitativement l'effet de la modulation de la force d'inertie. Le rapport ap / Dh des CTC à un rapport d'aspect de 0, 8 à 2 a été calculé avec 0, 17 à 0, 07, respectivement.

Après séparation du reste des cellules sanguines, les CTC contenant des cellules sanguines résiduelles (principalement des monocytes et des granulocytes) passent à la deuxième étape où une technique active est appliquée pour isoler avec précision les CTC des leucocytes. La force DEP fait référence à la force exercée sur le moment dipolaire induit d'une particule diélectrique et/ou conductrice par un champ électrique non uniforme69. La force n'agit que si le différentiel entre la permittivité de la particule et celle du fluide environnant existe. L'intensité de la force diélectrophorétique sur les particules dépend du gradient de permittivité entre la suspension et les particules. Si une cellule biologique homogène sphérique de rayon rp est placée dans un champ électrique variable tout en flottant dans un milieu, la force diélectrophorétique totale, en négligeant l'ordre supérieur de polarisation, peut être estimée à70

où ε0 = 8,854187817 × 10−12 F/m est la permittivité du vide, Re(CM) est la partie réelle du facteur Clausius–Mossotti décrit la variation de fréquence de la polarisabilité effective de la particule dans le milieu44,69. Cela dépend des permitivités complexes des cellules, du milieu de suspension et de la fréquence du champ électrique appliqué de l'extérieur70,71. Puisqu'il est fonction de la fréquence du champ électrique, il joue un rôle important dans le processus de séparation. Les cellules biologiques ne sont pas homogènes en raison de la membrane cellulaire de la bicouche lipidique et des structures et fluides intracellulaires. Par conséquent, pour calculer le facteur CM, nous avons considéré un modèle à coque unique présenté par70 en supposant une cellule comme une particule avec une fine couche externe (coquille) ou membrane cellulaire. . Le volume à l'intérieur des couches minces ou des structures intracellulaires et du fluide est supposé avoir une conductivité et une permittivité uniformes, mais les propriétés de la membrane cellulaire peuvent différer considérablement de celles du reste de la cellule. Dans le modèle à coque unique, lors du calcul du DEP, la permittivité relative complexe équivalente d'une particule homogène comprenant à la fois la membrane cellulaire et le cytoplasme de la cellule est appliquée à la place de la permittivité complexe de la particule. Si la permittivité complexe des cellules devient supérieure à celle du liquide en suspension \(\varepsilon_{p}^{*} > \varepsilon_{f}^{*}\), elle est qualifiée de DEP positive et attire les cellules vers le électrodes. En revanche, le DEP négatif repousse les cellules ou les particules de la région d'un champ électrique élevé.

Dans cette étude, la répulsion DEP négative est utilisée en combinaison avec la focalisation hydrodynamique. Le mécanisme de séparation en cas de séparation DEP consiste à trouver une fréquence AC, où les CTC subissent nDEP, tandis que les autres leucocytes restants subissent soit un DEP positif, soit aucun DEP (fréquence de croisement). La force DEP agissant sur les cellules est proportionnelle à leur volume cellulaire. La force totale \(F_{T} = { }F_{DEP} - f\nu ,\) agissant sur les cellules est donnée par la force diélectrophorétique, opposée à la force de traînée hydrodynamique. Où f est la force de traînée de Stokes et pour les petits nombres de Reynolds, elle est donnée par f = 6πηr, ν est la vitesse d'écoulement de la suspension cellulaire. Puisque les cellules sont traitées comme des objets sphériques rigides dans un milieu de viscosité η, la vitesse due au DEP est donc proportionnelle au carré du rayon de la cellule. La trajectoire de la particule est estimée après calcul des forces dans le champ d'écoulement. Le mouvement des cellules dans un fluide suit la seconde loi du mouvement de Newton72. La force nette sur une cellule au stade DEP est donnée par :

où mp est la masse cellulaire, \({\text{v}} = d{\text{q}}/dt\) est la vitesse cellulaire et q est la position de la cellule, FL, FD, Fdp et Fvm sont respectivement les forces de portance, de traînée, de gradient de pression et de masse virtuelle. Le facteur CM spécifie le signe de la force DEP en fonction de la fréquence de travail. La figure 2 illustre le facteur CM à l'aide d'un modèle à coque unique pour les types de leucocytes hGBM et IV par rapport à la fréquence appliquée. L'intensité de la force diélectrophorétique sur les particules dépend du gradient de permittivité entre la suspension et les particules. L'étage DEP se compose d'un ensemble d'électrodes interdigitées le long du canal principal pour la suspension cellulaire et de deux sorties pour les CTC et l'autre est le canal de déchets pour les leucocytes. La tension et la fréquence appropriées sont sélectionnées de sorte que lorsque le CTC s'approche des électrodes, il subit une force nDEP, l'amenant à s'éloigner de la zone de champ électrique élevé et éventuellement à la prise. Pendant ce temps, les leucocytes subiront pDEP et se déplaceront vers l'autre sortie. Comme la majeure partie du contenu du sang (non newtonien) a été éliminée lors de la première étape, une solution saline tampon phosphate (PBS) 0,1 × de faible conductivité 0,055 S/m ayant une permittivité relative de 78 a été sélectionnée pour la 2e étape. La vitesse des particules a été réduite en raison d'une augmentation de la largeur du canal de 50 à 175 µm. Cette réduction de vitesse a permis à toutes les cellules d'être exposées à la force DEP. Il a également diminué le champ électrique à travers la section transversale du canal, ce qui a entraîné la récupération de cellules viables, ce qui a facilité l'isolement des cellules au niveau des sorties.

La partie réelle du facteur Claussius – Mossotti (CM) du hGBM et des sous-types de leucocytes est cartographiée par rapport à la fréquence appliquée à l'aide d'un modèle à coque unique.

COMSOL Multiphysics v5.5 est utilisé pour modéliser le dispositif et un module d'analyse finie a été utilisé pour effectuer la simulation de dynamique des fluides computationnelle (CFD). COMSOL fournit une interface utilisateur graphique intégrée (GUI) où des modèles peuvent être construits et résolus en utilisant des modules physiques prédéfinis optimisés pour des domaines d'application spécifiques. Nous avons utilisé des modules d'écoulement de fluide, de système micro-électromécanique (MEMS) et de circuits électriques. L'objectif de la modélisation 2D et 3D était de calculer le champ d'écoulement, de valider les forces et de visualiser le processus de séparation au sein du dispositif proposé. Le modèle CAO de la géométrie a été développé à l'aide de la fonction de géométrie intégrée de COMSOL.

La conception proposée de l'étage de séparation inertielle courbe-CEA est inspirée des travaux de Shamloo et al. La largeur initiale de la région incurvée est de 50 μm et la longueur est de 1950 μm tandis que la largeur de la région d'expansion est de 350 μm et la longueur de 700 μm. La hauteur du canal est de 50 μm.

Après la conception de la géométrie, l'étape suivante consistait à définir le matériau par domaine du modèle. Bien que COMSOL soit complété par une énorme bibliothèque de matériaux, pour développer une conception de dispositif réaliste qui pourrait être utilisée pour des tests cliniques, les paramètres physiques de l'échantillon de sang humain associés aux deux étapes de séparation ont été extraits de la littérature73,76,77,78 et leurs valeurs sont dans le tableau 1. Cette étude s'est concentrée sur les cellules tumorales cérébrales ou les cellules de glioblastome humain (hGBM) pour lesquelles aucune séparation DEP antérieure n'a été rapportée dans la littérature ouverte.

Dans le constructeur de modèles COMSOL, les propriétés de simulation d'écoulement ont été définies dans le domaine microfluidique. Pour éviter une accumulation de cellules autour d'une zone aux angles vifs qui s'est produite en raison de plusieurs zones de vitesse nulle, des bords courbes ont été utilisés. Comme les bords pointus et les angles vifs n'étaient pas optimaux pour l'efficacité de la séparation des cellules75. Un maillage soigné a été fait pour éviter les erreurs telles que les éléments de maillage inversés. Un maillage très fin a été réalisé autour des régions pointues et courbes du chenal. Pour discrétiser le domaine de calcul de la géométrie proposée, un maillage structuré tétraédrique uniforme a été utilisé. Un maillage structuré a été utilisé pour discrétiser la géométrie de l'étage inertiel. Une analyse de l'indépendance du maillage a été effectuée, avec 145 046, 177 149 et 669 078 grilles ou éléments (Fig. 3). Une convergence satisfaisante des résultats a été obtenue avec des éléments de taille comprise entre 1,28 pour les mailles plus fines et 11,9 μm pour les mailles plus grossières. Le taux d'erreur maximal lié au nombre d'éléments donné était < 1 %.

La distribution de vitesse (composante y) le long de la ligne verticale tracée au centre de la région élargie montre la variation de vitesse dans la région spécifiée du canal microfluidique. L'analyse de convergence du maillage a été effectuée avec 145 046, 177 149 et 669 078 éléments ou grilles, c'est-à-dire (réglages de maillage plus grossier, normal et plus fin). Le tracé linéaire indique la convergence du maillage pour la taille de grille de 1,28 µm.

La méthode des éléments finis (FEM) a été implémentée à l'aide d'un module d'écoulement de fluide. Les résultats obtenus à partir de la simulation d'écoulement laminaire ont été utilisés comme entrée pour le module de traçage des particules. Ce qui a généré à son tour la trajectoire des particules dans le domaine microfluidique conçu. Par la suite, les EDP gouvernantes ont été résolues à l'aide du logiciel de simulation. L'équation de Navier-Stokes et les équations de quantité de mouvement (convection-diffusion non linéaire) ont été résolues pour la distribution du champ d'écoulement. Pour un faible rapport hauteur/largeur, ap/Dh est considéré comme < 1, c'est pourquoi le débit a été choisi entre 120 et 200 µl/min. Les deux entrées ont été définies par des débits de 20 et 200 μl/min pour un échantillon de sang et un flux de focalisation, respectivement. Une condition aux limites de pression nulle a été appliquée sur les sorties du canal microfluidique et une condition aux limites sans glissement a été utilisée pour les murs. La formulation des moindres carrés de Galerkin a été utilisée pour approximer les EDP non linéaires gouvernant avec un système d'équations différentielles ordinaires (ODE). L'écoulement laminaire avec discrétisation (P2 + P2) a été résolu pour l'écoulement de fluide. Il en résulte des forces de portance et de traînée inertielles nettes ainsi que la masse virtuelle et la force de gradient de pression à utiliser dans le module de traçage des particules pour estimer le mouvement de la cellule. Pour l'échantillon de sang à injecter à l'entrée, un groupe de cellules comprenant sept lignées cellulaires : 24 globules rouges, 12 plts, 12 globules blancs (granulocytes, monocytes, lymphocytes T, lymphocytes B) et 3 CTC est sélectionné. Le nombre de cellules (réduit) mentionné ci-dessus était basé sur la quantité réelle des mêmes cellules dans le sang humain. Une étude en fonction du temps avec un pas de temps de 0,0001 s a été réalisée dans le module de traçage des particules. Les équations de mouvement ont été résolues en tenant compte de la force de traînée de Stokes avec des corrections de paroi, de la force de portance incluant le gradient induit par la paroi et de cisaillement, la masse virtuelle et la force du gradient de pression.

La géométrie principale, utilisée pour la comparaison des modèles dans cette étude, consiste en une région courbe et une région d'expansion. La largeur initiale de la région incurvée est de 50 μm et la longueur est de 1950 μm tandis que la largeur de la région d'expansion est de 350 μm et la longueur de 700 μm. La hauteur du canal est de 50 μm. Pour la zone de contraction, un rapport d'aspect (AR = H/W) de 1 est sélectionné. Cette quantité a été choisie avec soin car elle est essentielle pour une bonne séparation. Tout d'abord, la simulation a été effectuée en utilisant seulement deux particules modèles de taille 4 et 10 µm sur la géométrie primaire (Fig. 4) et les résultats ont été comparés aux résultats rapportés par Shamloo et al.79 élaborés dans la Fig. 5. L'efficacité de séparation peut être déterminé comme le rapport du CTC obtenu à la sortie du CTC à la quantité totale de CTC injectée à l'entrée. Le modèle simulé décrit la position de la concentration cellulaire maximale avec un espace de séparation. Pour visualiser la séparation des cellules, les particules ont été colorées en fonction de leur taille sur la Fig. 4.

Résultats de la simulation sur la géométrie primaire avec une seule architecture AR à faible rapport hauteur/largeur contractée, courbée et étendue. Des particules modèles de tailles 4 et 10 µm ont été injectées avec le flux de gaine. La simulation montre la séparation des particules avec un espace de séparation visible.

Comparaison des résultats de simulation de géométrie primaire et des données disponibles dans la littérature. L'écart de séparation moyen entre les particules de 4 et 10 µm et le rendement s'est avéré supérieur dans la simulation effectuée. Cependant, la pureté des deux tailles de cellules était similaire aux données rapportées.

La comparaison est raisonnable mais en raison des différentes tailles de cellules à l'étude et de l'intégration en série du stade DEP, la même conception n'a pas fonctionné pour la séparation hGBM. Ainsi, après avoir établi la procédure d'analyse de l'étape de focalisation inertielle, la conception personnalisée pour la séparation des RBC et des Plt des WBC et des CTC est finalisée en incorporant des changements géométriques. Des sorties de bifurcation de différentes tailles et formes ont été conçues et testées pour la séparation et la collecte des GR, Plts , WBC et CTC. La conception initiale des points de vente a été faite sur la base de l'espace de séparation entre les cellules cibles. effet centrifuge et loi de bifurcation de Zweifach-Fung80. Les figures 6a à d montrent différentes conceptions de sorties indiquant le changement qui s'est produit dans l'efficacité et la pureté de la séparation. La conception affichée en (d), a démontré la meilleure force de séparation tout en validant les résultats précédents. Par conséquent, la conception de bifurcation (d) a été sélectionnée pour la phase de focalisation inertielle, la sortie supérieure est pour les RBC et Plt rejetés tandis que l'autre est utilisée pour transporter le CTC et le WBC pour une séparation supplémentaire. Une fois la conception finalisée, plusieurs simulations ont été effectuées pour déterminer l'efficacité et la pureté de la séparation, c'est-à-dire le rapport du nombre de cellules collectées dans la sortie souhaitée au nombre total de cellules dans cette sortie. à différents rapports d'aspect.

Différentes prises conçues mettent en évidence la sélection de la phase de focalisation inertielle. Pour visualiser l'efficacité de la séparation, les particules sont colorées en fonction de leur taille. (a) Les sorties sont conçues en fonction de l'écart de concentration des particules dans le modèle initial. (b) Tailles de sortie modifiées (c) Taille de sortie des déchets augmentée (d) La bifurcation symétrique des sorties entraîne la séparation efficace du CTC du reste des cellules sanguines.

Nous avons observé que les cellules commencent à se concentrer lorsque la force d'inertie domine la force de traînée dean autour de ap /Dh ~ 0,1. À partir de cela, nous pouvons prédire que la séparation du CTC des autres cellules sanguines peut être effectuée à la géométrie courbe-CEA conçue sous une hauteur de 70 μm avec un nombre de Reynolds Re supérieur à 18.

Pour la simulation de l'étape de séparation DEP, des modules de courant électrique, d'écoulement de fluide et de traçage de particules ont été utilisés. Le modèle consiste en un état stationnaire stationnaire, un domaine fréquentiel et une étude transitoire. Les champs de distribution de vitesse, de pression et de potentiel électrique CA ont été calculés à l'aide d'une étude stationnaire, tandis que l'étude transitoire a été utilisée pour générer des trajectoires de particules influencées par la force DEP. Pour la physique des courants électriques, la condition aux limites d'isolation électrique a été retenue pour les parois du microcanal. La définition du potentiel électrique sur les électrodes annulerait les emplacements des électrodes à l'intérieur des murs. Des électrodes de forme carrée avec des côtés de 80 μm ont été utilisées, ce qui est faisable pour la fabrication. Pour générer un champ électrique, des électrodes de même tension et de signes alternés ont été utilisées. Un potentiel électrique allant de 3,5 à 5 V a été appliqué sur les électrodes. Pour calculer le champ électrique, le maillage fin a opté tandis que le maillage grossier a été généré pour résoudre le champ d'écoulement de fluide. Différents maillages ont été utilisés près des angles vifs pour affiner la solution. Pour l'étude stationnaire de l'écoulement des fluides, un solveur multigrille algébrique (AMG) ou un préconditionneur a été utilisé comme solveur linéaire, le champ électrique a été calculé à l'aide du solveur itératif BiCGStab et le solveur itératif GMRES avec la méthode Jacobi a été utilisé pour le suivi des cellules. Dans le cas du traçage des particules, la condition aux limites des parois du canal de l'étape DEP a été définie sur "rebondir" et la condition des sorties a été définie sur "coller", ce qui signifie que les cellules rebondiraient ou colleraient aux sorties en cas de collision, respectivement. Les cellules séparées (CTC et WBC) de la sortie du premier étage entrent dans le domaine du deuxième étage. Étant donné que la majeure partie du volume est rejetée avec les globules rouges et les plaquettes au stade inertiel, plus de tampon (0,1xPBS) était nécessaire pour le flux de focalisation. La suspension fluide était un écoulement newtonien sur l'ensemble de cette étape, ayant donc une faible conductivité électrique ~ 0,055 S/m. Une telle configuration génère à la fois une force pDEP et nDEP pour déplacer les cellules vers ou loin des électrodes, respectivement. Du chemin des leucocytes et du CTC, le premier a été repéré près des électrodes. Par conséquent, on peut conclure que la force pDEP est imposée aux WBC tandis que les CTC subissent la force nDEP.

Dans cet article, un canal microfluidique inertiel a d'abord été simulé numériquement sur la base de l'étude de Shamloo et al. La conception de l'appareil a été modifiée en fonction de l'échantillon souhaité, c'est-à-dire du sang total après vérification de la géométrie de base à la lumière des résultats de l'enquête de Shamloo et al.79 Les particules qui ont été examinées étaient de 12,2, 6,58, 9,26, 9,42, 4 et 2 µm de diamètre représentant respectivement les CTC, les WBC (quatre principaux types), les GR et les plaquettes. Pour trouver les paramètres de conception optimaux, la relation entre le rapport d'aspect du canal, le débit et l'efficacité de séparation a été étudiée. Ensuite, l'étage DEP a été conçu séparément puis intégré en série avec le microcanal inertiel pour faciliter et améliorer l'isolement du CTC de l'échantillon de sang total.

Le modèle proposé tire parti des géométries de séparation courbes et de la matrice de contraction-expansion (CEA). Des forces d'inertie supplémentaires sont introduites lorsque le microcanal est incurvé ou que son rapport d'aspect change (par exemple, des géométries curvilignes et des CEA, respectivement). De tels changements géométriques induisent un flux de Dean secondaire transversal dans le microcanal. L'architecture combinée a été conçue pour renforcer les tourbillons d'écoulement de Dean au niveau de séparation dans une longueur distinctive plus courte par rapport aux géométries CEA droites. Initialement, seules quatre lignées cellulaires ont été considérées, c'est-à-dire RBC, Plt, WBC et hGBM. Deux tourbillons de Dean générés dans le canal (Fig. 7) se renforcent mutuellement, ce qui donne l'amplitude de vitesse maximale pour obtenir une efficacité de séparation et une pureté maximales pour les CTC.

Le vortex d'écoulement secondaire ou les vortex d'écoulement Dean apparaissent dans le canal incurvé et changent leur force le long de la largeur pour atteindre une amplitude de vitesse maximale. Les flèches indiquent la force de traînée Dean. L'équilibre entre les forces de traînée et de portance inertielle détermine la direction finale de la particule à travers le canal en fonction de la taille des particules. Les particules plus petites suivent la ligne de courant d'écoulement et se déplacent vers la sortie supérieure tandis que les particules de grande taille se déplacent vers la sortie inférieure.

La plupart de la littérature disponible considère le diamètre moyen des globules blancs et néglige les variantes réelles des globules blancs ou des leucocytes. Cela ajoute une erreur ou une limitation inhérente aux résultats. Compte tenu des conditions pratiques, nous avons ajouté des sous-types de globules blancs dans notre modèle, à savoir les monocytes, les lymphocytes T, les lymphocytes B et les granulocytes. Les propriétés mécaniques et diélectriques ont été exploitées pour séparer les WBC (granulocytes et monocytes) des CTC. Notre analyse montre que seuls les CTC sont concentrés vers le côté droit du canal, Fig. 8, alors que d'autres cellules se sont accumulées sur la gauche. Comme discuté précédemment, les grandes cellules, c'est-à-dire les CTC, sont influencées par la force de portance inertielle, qui les maintient à une position presque constante par rapport à la paroi du canal. Au contraire, le flux de Dean créé dans la région incurvée conduit le reste des cellules plus petites à se concentrer vers la sortie # 2 de l'étape 1. La figure 8 montre les trajectoires des cellules à partir du module de traçage des particules, de manière intéressante les lymphocytes T et B ( 6,58 μm) ont été séparés avec les globules rouges et les plts tandis que les granulocytes et les monocytes sont de taille comparable aux CTC ont été livrés au stade DEP avec les CTC. Il a été observé que les leucocytes ayant des tailles proches de Plts et RBC (2-6 µm) sont drainés avec eux. Tandis que certains types de leucocytes ayant des diamètres proches du CTC (9-12,2 µm) s'entendent, se frayant un chemin jusqu'au deuxième étage du dispositif microfluidique. Ces résultats ont validé notre hypothèse selon laquelle la géométrie combinée avec courbe et CEA pourrait obtenir les résultats requis avec des longueurs plus petites.

Résultats du traçage des particules d'un échantillon de sang total en tenant compte des sous-types de leucocytes. La légende des couleurs indique la taille des particules injectées. Dans la région d'expansion, la séparation des petites particules, c'est-à-dire les RBC et les plaquettes, a lieu à partir des particules plus grosses, c'est-à-dire les CTC et les WBC, et elles continuent à se déplacer vers leurs sorties respectives. Cependant, il a été observé que certains sous-types de globules blancs se sont frayés un chemin avec les globules rouges et les plt vers la sortie des déchets pour le rejet initial des globules rouges et des plt.

Pour évaluer les performances de l'étage inertiel proposé, nous avons calculé l'efficacité de séparation et la pureté de la suspension cellulaire à différents rapports d'aspect allant de 0,8 à 2. Généralement, il a été observé que l'efficacité de séparation est faible lorsque le rapport d'aspect est < 1. À un rapport d'aspect de 1, l'efficacité de séparation du premier étage augmente à 100 % (Fig. 9). Entre le rapport d'aspect 1 et 2, certains types de globules blancs dont la taille est comparable à celle des globules rouges ont également migré vers la sortie #1. Dans l'ensemble, l'efficacité de séparation des globules rouges et des plaquettes de 100 % est obtenue pour un rapport d'aspect ≥ 1. Le seuil du rapport ap/Dh est observé à ~ 0,1 pour une efficacité de séparation maximale, comme indiqué par81.

Efficacité de séparation par rapport au rapport d'aspect des globules rouges et des plaquettes. Le faible AR de la géométrie combinée proposée s'est avéré approprié pour une efficacité de séparation maximale.

La distribution du champ de vitesse du dispositif microfluidique à deux étages est représentée sur la figure 10. Le tracé de surface montre une diminution de la vitesse lorsque le fluide a été transféré vers la région d'expansion, puis vers les canaux aval bifurqués symétriques. Cela se produit en raison de la résistance hydraulique, qui est directement liée à la pression dynamique du fluide. L'amplitude de la vitesse change en raison du changement de force du vortex d'écoulement secondaire et en raison des changements géométriques à travers le canal. La vitesse des particules a été réduite en raison d'une augmentation de la largeur du canal de 50 à 175 μm. Cette réduction de vitesse a par la suite ralenti les cellules et leur a permis d'être exposées à la force DEP. Il a également diminué le champ électrique à l'intérieur du canal, ce qui a entraîné la récupération de cellules viables, ce qui a facilité l'isolation des cellules aux points de vente.

Distribution du champ de vitesse du dispositif hybride proposé. Le tracé de surface de la vitesse indique le champ de vitesse dans le dispositif proposé dans le spectre de couleurs. Lorsque le tampon de focalisation est injecté, la vitesse autour de son entrée est élevée (représentée par la région rouge). La suspension cellulaire a été injectée à faible vitesse, abaissant ainsi la vitesse du flux de fluide dans la région contractée courbe (représentée par la région verte). Lorsque le fluide pénètre dans la région dilatée, il réduit encore la vitesse (représentée par la région bleue). A la fin de l'étage inertiel, le canal unique est bifurqué, donc divisant, puis réduisant le débit volumétrique. La taille du canal de l'étage DEP est encore augmentée. Cette égalisation de la résistance hydraulique favorise la distribution uniforme de l'écoulement à travers l'étage DEP, où un spectre uniformément bleu est obtenu avec la simulation d'écoulement de fluide.

La figure 1 montre la conception proposée de l'étape DEP, pour assurer une séparation continue des cellules avec le débit de fluide, la pression dynamique et la vitesse générées dans le canal conçu ont été analysées. Pour la continuité effective de l'écoulement, la pression de fluide dynamique du canal microfluidique a été examinée. L'étage DEP est régi par des paramètres tels que la tension appliquée, la fréquence et le nombre d'électrodes. Le facteur CM des leucocytes et du hGBM est calculé par rapport à la fréquence appliquée sur la figure 2. Les fréquences de croisement des leucocytes, c'est-à-dire des monocytes, des granulocytes, des lymphocytes T et des lymphocytes B, vont de 220 à 330 kHz. Cependant, la fréquence de croisement de hGBM est d'environ 511 kHz. Par conséquent, pour isoler les CTC des leucocytes, une fréquence comprise entre 331 et 500 kHz peut être utilisée pour induire pDEP aux leucocytes et nDEP au hGBM.

Nous avons étudié sous pDEP l'importance de la différence de comportement entre toutes les variantes de leucocytes en fixant d'abord la fréquence appliquée à 350 kHz. La tension peut varier dans une large gamme. Étant donné que les cellules sont vulnérables à un champ électrique élevé, des tensions de fonctionnement faibles sont plus souhaitables. Par conséquent, nous examinons le processus de séparation des cellules en utilisant des fréquences comprises entre 350 et 400 kHz et des tensions entre 2 et 5 V. On observe que pour séparer les leucocytes des CTC, pour une combinaison donnée de tension et de fréquence, un nombre défini d'électrodes est nécessaire. . L'utilisation de neuf électrodes a assuré une séparation suffisante à une fréquence de 370 kHz. lune et collègues; dans le même sens, le cancer colorectal et la lucémie ont également été signalés plus tôt, ce qui appuie nos conclusions actuelles par39,82,83,84.

Résultat du traçage de particules. Séparation réussie du CTC des leucocytes au stade DEP. La suspension cellulaire avec distribution aléatoire de leucocytes et de CTC provenant de l'étage inertiel entre dans l'entrée de l'étage DEP. Les lignes de couleur sont des trajectoires cellulaires, le bleu et ses nuances représentent les leucocytes tandis que les CTC sont représentés par la couleur rouge.

Cette étude démontre la conception et la simulation d'un dispositif de tri microfluidique en deux étapes hautement spécifique, continu et sans étiquette basé sur la focalisation inertielle et le DEP pour isoler les CTC (hGBM) du sang total. Les travaux actuels visent à résoudre les limites de la méthode DEP en ajoutant une étape de séparation basée sur la taille avant l'enrichissement. Au stade de pré-enrichissement, les petites cellules (généralement les globules rouges et les plt) constituent la majeure partie du volume sanguin, c'est-à-dire que 45 % sont séparés. Ces cellules sont responsables de la conductivité sanguine et de la nature non newtonienne. Les séparer dans la phase initiale augmente la pureté et l'efficacité de l'isolement des CTC. Les leucocytes restants et les CTC ayant des tailles comparables (9,26 à 12,2 µm) ont été transportés au stade DEP où la séparation est effectuée en fonction des propriétés électriques des cellules susmentionnées. Les CTC résultants sont viables et peuvent être davantage utilisés pour le diagnostic et la conception d'une thérapie spécifique au patient, rendant ainsi la méthodologie proposée plus utile. Les résultats montrent un niveau de pureté de 99,5 % avec un débit élevé de 12,2 ml/h. Pour améliorer l'efficacité de la séparation, plusieurs simulations informatiques ont été effectuées pour vérifier la conception et l'intégration proposées. Cette simulation de dispositif intégré a démontré le tri efficace des cellules à l'aide de notre dispositif inertiel-DEP à deux étages. Dans la première étape, de petits globules rouges et Plt ont été séparés des échantillons de sang à l'aide de la technique de focalisation inertielle. Les grandes cellules comme les CTC et les leucocytes ont été séparées les unes des autres en utilisant la force DEP. La plupart des chercheurs ont utilisé des échantillons dopés ou binaires pour les tests, ce qui entraîne une limitation inhérente aux pratiques cliniques. Nous avons utilisé un échantillon de sang total avec du PBS avec un taux de dilution admissible de 1:10. Nous avons utilisé hGBM comme CTC dans notre enquête pour laquelle aucune séparation DEP n'a été signalée au meilleur de notre connaissance. Cependant, le dispositif proposé peut être utilisé pour isoler d'autres types de cellules tumorales (à condition que la taille soit comparable à celle des leucocytes) en modifiant les paramètres de conception du stade DEP, c'est-à-dire la fréquence et la tension appliquées.

La conception de l'appareil proposé avait un concept pour surmonter le problème de la perte de cellules, de la fragmentation des cellules, de la cytotoxicité et de la déformation des cellules qui se produisait pendant la préparation de l'échantillon pour la plupart des types de méthodes de séparation des cellules. L'étude a utilisé la méthode de séparation par flux inertiel au lieu de la centrifugation. Habituellement, la centrifugation est effectuée comme condition préalable à la préparation d'échantillons de tests cliniques ou de laboratoire, ce qui provoque les problèmes mentionnés ci-dessus. Comme les leucocytes et la plupart des CTC ont une taille similaire, la méthode inertielle n'est donc pas très populaire pour le tri des CTC en raison de la contamination par les globules blancs ou les leucocytes. La présente étude a utilisé la méthode DEP sans étiquette qui trie différents types de cellules en fonction de leur mouvement en réponse au champ DEP. Cela est dû aux différences de fréquence de croisement des cellules en raison de leurs propriétés diélectriques uniques. L'étude utilise une méthode en deux étapes réduisant ainsi la population cellulaire, ainsi que la basse tension et la fréquence réduisent la possibilité d'échauffement par effet Joule et de lyse cellulaire. Bien que cette méthode ait une efficacité d'isolation élevée, elle souffre d'un faible volume de traitement, d'un risque de colmatage des cellules dû à une surcharge et d'un échauffement par effet Joule dû aux tensions appliquées. Le volume de traitement global limité est dû à l'intégration en série. La conception de notre appareil offre une efficacité d'isolation globale ou une récupération des cellules allant jusqu'à 99,5 %. Dans l'ensemble, notre étude de simulation actuelle a le potentiel d'un dispositif très efficace, cependant, les variations génétiques dans l'échantillon, les variations dues à la race et à la présence d'autres maladies ainsi que les thérapies médicinales qui peuvent affecter la consistance, la viscosité, la toxicité cellulaire, etc.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Maliha Saleem Bakhshi & Mohsin Rizwan

Département de pharmacologie et de thérapeutique, Faculté des sciences pharmaceutiques, Université du Pendjab central, Lahore, Pakistan

Ghulam Jilany Khan

École d'ingénierie biologique et alimentaire, Centre de recherche en ingénierie pour le développement et l'utilisation à haute valeur ajoutée de matériaux médicinaux authentiques dans la province du nord de l'Anhui, Université de Suzhou, Suzhou, Anhui, 234000, Chine

Hong Duan et Kefeng Zhai

Laboratoire clé de chimie et de génie moléculaire des ressources médicinales (Université normale du Guangxi), Guilin, 541004, République populaire de Chine

Kefeng Zhai

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BMS a conçu l'idée, réalisé l'étude et écrit le manuscrit et KGJ a conceptualisé l'idée, organisé les études et écrit le texte principal du manuscrit et DH a préparé les figures 4, 5, 6, 7, 8 et 9 pour la clarté de la compréhension. RM a supervisé les études et révisé le manuscrit et ZKF a révisé le manuscrit et est l'auteur correspondant.

Correspondance à Mohsin Rizwan, Hong Duan ou Kefeng Zhai.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Bakhshi, MS, Rizwan, M., Khan, GJ et al. Conception d'une nouvelle puce microfluidique intégrée pour la séparation continue des cellules tumorales circulantes des cellules sanguines périphériques. Sci Rep 12, 17016 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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Reçu : 09 mai 2022

Accepté : 20 septembre 2022

Publié: 11 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-20886-1

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