Nouvelles connaissances sur la rhéotaxie, l'agglutination et la formation de faisceaux de spermatozoïdes chez les poulets Sharkasi sur la base d'une étude in vitro

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 13003 (2022) Citer cet article

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La fertilité chez les oiseaux dépend de leur capacité à stocker des populations adéquates de sperme viable pendant des durées prolongées dans les tubules de stockage du sperme (SST). Les mécanismes exacts par lesquels les spermatozoïdes entrent, résident et sortent des SST sont encore controversés. Le sperme de poulet Sharkasi a montré une forte tendance à s'agglutiner, formant des faisceaux filiformes mobiles comprenant de nombreuses cellules. Puisqu'il est difficile d'observer la motilité et le comportement des spermatozoïdes à l'intérieur de l'oviducte opaque, nous avons utilisé un dispositif microfluidique avec une section microcanale ressemblant à celle des glandes spermatiques permettant l'étude de l'agglutination des spermatozoïdes et du comportement de la motilité. Cette étude explique comment les faisceaux de spermatozoïdes se forment, comment ils se déplacent et quel rôle ils peuvent avoir dans l'extension de la résidence des spermatozoïdes à l'intérieur des SST. Nous avons étudié la vitesse des spermatozoïdes et le comportement de rhéotaxie lorsqu'un flux de fluide a été généré à l'intérieur d'un canal microfluidique par pression hydrostatique (vitesse d'écoulement = 33 µm/s). Les spermatozoïdes avaient tendance à nager à contre-courant (rhéotaxie positive) et les faisceaux de spermatozoïdes avaient une vitesse significativement inférieure à celle des spermatozoïdes isolés. On a observé que les faisceaux de sperme nageaient dans un mouvement en spirale et augmentaient en longueur et en épaisseur à mesure que davantage de spermatozoïdes solitaires étaient recrutés. Des faisceaux de sperme ont été observés s'approchant et adhérant aux parois latérales des canaux microfluidiques pour éviter d'être balayés avec une vitesse d'écoulement de fluide > 33 m/s. La microscopie électronique à balayage et à transmission a révélé que les faisceaux de sperme étaient soutenus par une substance dense et abondante. Les résultats montrent la motilité distincte du sperme de poulet Sharkasi, ainsi que la capacité du sperme à s'agglutiner et à former des faisceaux mobiles, ce qui permet de mieux comprendre le stockage à long terme du sperme dans les SST.

Pour réaliser la fécondation chez les humains et la plupart des animaux, les spermatozoïdes et les ovules doivent atteindre le site de fécondation au bon moment. Par conséquent, la copulation doit avoir lieu avant ou pendant l'ovulation. Certaines espèces de mammifères, telles que les chiens et les classes non mammifères, telles que les insectes, les poissons, les reptiles et les oiseaux, stockent le sperme dans leurs organes reproducteurs pendant de longues périodes jusqu'à ce que leurs œufs soient prêts à être fécondés (fécondation asynchrone1 ). Les oiseaux sont capables de maintenir des spermatozoïdes viables capables de féconder les ovules pendant des périodes allant de 2 à 10 semaines2.

Il s'agit d'une caractéristique unique qui distingue les oiseaux des autres animaux car elle permet une forte probabilité de fécondation après une seule insémination sur plusieurs semaines sans qu'il soit nécessaire de synchroniser l'accouplement et l'ovulation. Le principal organe de stockage du sperme, appelé tubules de stockage du sperme (SST), est situé dans les plis muqueux internes de la jonction utéro-vaginale3. À ce jour, les mécanismes d'entrée, de résidence et d'évacuation des spermatozoïdes des réservoirs de sperme ne sont pas entièrement compris. Selon des enquêtes antérieures, un certain nombre d'hypothèses ont été proposées à ce sujet, mais aucune d'entre elles n'a été confirmée.

Forman4 a proposé que les spermatozoïdes maintiennent leur résidence dans la lumière des SST par un mouvement oscillatoire continu contre la direction d'un fluide circulant à travers les canaux protéiques situés sur les cellules épithéliales des SST (rhéotaxie). En raison de l'activité continue des flagelles nécessaire pour maintenir les spermatozoïdes à l'intérieur de la lumière SST, l'ATP est épuisé et la motilité est finalement diminuée jusqu'à ce que les spermatozoïdes soient transportés à l'extérieur des réservoirs de sperme par le flux de fluide pour commencer un nouveau voyage en remontant l'oviducte pour fertiliser le ovule (Forman4). Ce modèle de stockage du sperme est étayé par les résultats confirmant la présence d'aquaporines 2, 3 et 9 dans l'épithélium des SST par immunocytochimie5. À ce jour, les études sur la rhéotaxie des spermatozoïdes chez les poulets et le rôle qu'elle peut jouer dans le stockage des SST, la sélection vaginale des spermatozoïdes et la compétition des spermatozoïdes font défaut. Chez les poulets, l'éjaculat de sperme est déposé dans le vagin après l'accouplement naturel; cependant, plus de 80 % des spermatozoïdes sortent du vagin peu de temps après la copulation6. Cela suggère que le vagin est le principal site de sélection des spermatozoïdes chez les espèces aviaires. De plus, il a également été rapporté que moins de 1 % des spermatozoïdes inséminés dans le vagin pénètrent dans les SST2. Lorsque les poulets étaient inséminés artificiellement dans le vagin, le nombre de spermatozoïdes qui atteignaient les SST avait tendance à augmenter, 24 h après l'insémination. Jusqu'à présent, le mécanisme de sélection des spermatozoïdes dans ce processus était inconnu, et la motilité des spermatozoïdes peut jouer un rôle important dans l'absorption des spermatozoïdes dans les SST4. Il est difficile de surveiller la motilité des spermatozoïdes dans l'oviducte directement chez les espèces d'oiseaux en raison de la paroi épaisse et opaque de l'oviducte. Par conséquent, nous manquons de connaissances de base sur la façon dont les spermatozoïdes sont transférés dans les SST après l'insémination.

La rhéotaxie a récemment été considérée comme un facteur important contrôlant le transport des spermatozoïdes dans les organes génitaux des mammifères7. Sur la base de la capacité des spermatozoïdes viables à migrer contre un flux, Zaferani et al.8 ont utilisé un système de corral microfluidique pour isoler passivement les spermatozoïdes mobiles de l'échantillon de sperme à l'intérieur d'un corral. Ce tri des spermatozoïdes est nécessaire pour les traitements médicaux de l'infertilité et les études cliniques et est privilégié par rapport aux méthodes conventionnelles qui prennent du temps et du travail et pourraient nuire à la morphologie et à l'intégrité de la structure des spermatozoïdes8. Cependant, jusqu'à présent, il n'y a eu aucune étude sur l'effet du flux dans les organes génitaux des poulets sur la motilité des spermatozoïdes.

Indépendamment du mécanisme qui maintient les spermatozoïdes stockés dans les SST, un certain nombre de chercheurs ont observé que les spermatozoïdes résidents s'agglutinent « tête à tête » en formant des faisceaux de sperme agglutiné dans les SST des poulets9,10, des cailles2 et des dindes11. Les auteurs ont suggéré qu'il existe une relation entre cette agglutination et la période prolongée de stockage du sperme dans les SST.

Tingari et Lake12, ont signalé l'association étroite entre les spermatozoïdes dans les glandes spermatozoïdes hôtes des poules et étaient curieux de savoir si les spermatozoïdes aviaires s'agglutinaient de la même manière que le sperme des mammifères. Ils ont suggéré que la connexion profonde entre les spermatozoïdes dans les glandes spermatiques pourrait être due à la pression causée par l'existence d'un grand nombre de spermatozoïdes dans un petit espace.

Des preuves transitoires d'agglutination étaient visibles lorsque le comportement des spermatozoïdes était évalué dans des lames fraîches suspendues, notamment le long du bord de la gouttelette de sperme. Cependant, l'agglutination était fréquemment perturbée par l'action tourbillonnante associée à une motilité continue, expliquant le caractère fugace de ce phénomène9. Les chercheurs ont également noté des agrégations cellulaires allongées "en forme de fil" lorsque le diluant était ajouté au sperme.

Une première tentative de simulation des glandes spermatiques a été réalisée en retirant un fil délicat d'une lame suspendue, ce qui a provoqué la saillie d'une vésicule allongée de la gouttelette de sperme, semblable à une glande spermatique9. Les spermatozoïdes se sont instantanément alignés selon un schéma parallèle dans la vésicule, mais l'unité globale s'est rapidement estompée en raison des limitations tridimensionnelles. Par conséquent, afin d'étudier les agglutinations de sperme, il est nécessaire d'observer le mouvement et le comportement des spermatozoïdes directement dans des tubules de stockage de sperme isolés, ce qui est difficile à réaliser. Par conséquent, la conception d'un outil simulant la glande spermatique est nécessaire pour soutenir les études sur la motilité des spermatozoïdes et le comportement d'agglutination. Brillard et al.13 ont rapporté que la longueur moyenne des tubules de stockage du sperme chez les poules matures est de 400 à 600 µm, mais certaines SST peuvent mesurer 2 000 µm. Mero et Ogasawara14 ont classé les spermatozoïdes en tubules de stockage de sperme élargis et non élargis, qui avaient tous deux des longueurs (environ 500 µm) et des largeurs de cou (environ 38 µm) similaires, mais les tubules des deux groupes avaient des diamètres moyens de lumière de 56,6 et 11,2 µm, respectivement. Dans l'étude actuelle, nous avons utilisé un dispositif microfluidique avec des dimensions de canal de 200 µm × 20 µm (W × H) pour donner une section quelque peu proche de celle des SST agrandies. De plus, nous avons étudié la motilité des spermatozoïdes et le comportement d'agglutination dans un fluide en écoulement pour être en accord avec l'hypothèse de Forman selon laquelle les cellules épithéliales des SST produisent un fluide qui maintient les spermatozoïdes dans la lumière en nageant dans le sens de l'écoulement (rhéotaxie).

Les objectifs de l'étude étaient de surmonter les problèmes d'observation de la motilité des spermatozoïdes à l'intérieur de l'oviducte et d'éviter les difficultés d'étudier la rhéotaxie et le comportement des spermatozoïdes dans un environnement dynamique. Un dispositif microfluidique qui a généré une pression hydrostatique pour modéliser la motilité des spermatozoïdes à l'intérieur des organes génitaux des poulets a été utilisé.

Lorsqu'une goutte d'échantillon de sperme dilué (1:40) a été chargée à l'intérieur du dispositif à microcanaux, deux types de motilité des spermatozoïdes (solitaires et en faisceaux) ont été reconnus. De plus, les spermatozoïdes avaient tendance à nager à contre-courant (rhéotaxie positive ; Vidéos 1, 2). Bien que les faisceaux de spermatozoïdes aient une vitesse inférieure à celle des spermatozoïdes solitaires (p <0, 001), ils ont augmenté le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive (p <0, 001; tableau 2). Le pourcentage de rhéotaxie positive a été estimé à environ 53 % et 85 % pour les spermatozoïdes solitaires et les faisceaux, respectivement.

On a observé que les spermatozoïdes des poulets Sharkasi formaient des faisceaux filiformes composés de plusieurs dizaines d'individus immédiatement après l'éjaculation. Ces faisceaux augmentent en longueur et en épaisseur avec le temps et peuvent rester in vitro pendant des heures avant de se disperser (Vidéo 3). Ces faisceaux filiformes ont une forme similaire à ceux du sperme d'échidné formé dans le segment terminal de l'épididyme. Le sperme de poulet Sharkasi s'est avéré avoir une forte tendance à s'agglutiner et à former un réseau de faisceaux moins d'une minute après la collecte. Ces faisceaux sont mobiles et sont capables de coller à n'importe quel mur adjacent ou objet statique. Bien que les faisceaux de spermatozoïdes réduisent la vitesse des spermatozoïdes, il était évident qu'ils augmentent leur linéarité macroscopiquement. Les faisceaux varient en longueur en fonction du nombre de spermatozoïdes assemblés dans le faisceau. Deux segments du faisceau sont reconnus : la partie initiale, qui comprend les têtes libres du sperme agglutiné, et la partie terminale, comprenant les queues et le sperme distal entier. A l'aide d'une caméra à haute vitesse (950 images/s), nous avons observé que les têtes libres des spermatozoïdes agglutinés, à la partie initiale du faisceau, sont responsables de la motilité du faisceau en raison de leurs mouvements oscillatoires, qui entraînent le reste de la faisceau dans un mouvement en spirale (Vidéo 4). Cependant, dans les longs faisceaux, on a observé que certaines têtes libres de sperme adhérant dans le corps et la partie terminale du faisceau agissent comme des palettes et aident au mouvement du faisceau.

Les faisceaux de spermatozoïdes se déplaçaient parallèlement les uns aux autres lorsqu'ils étaient présents dans un flux de fluide lent; cependant, ils commencent à se chevaucher et à coller à tout objet stationnaire afin de ne pas être emportés par le courant qui circule lorsque la vitesse du flux augmente. La formation du faisceau commence avec quelques spermatozoïdes se rapprochant les uns des autres, et ils commencent à se déplacer de manière synchrone et à s'enrouler les uns autour des autres, puis à coller à la substance adhésive. Les figures 1 et 2 montrent des spermatozoïdes se rapprochant l'un de l'autre formant un point de connexion en raison des queues qui s'enroulent l'une autour de l'autre.

Les chercheurs ont appliqué une pression hydrostatique pour créer un flux de fluide à l'intérieur du microcanal où la rhéotaxie des spermatozoïdes a été étudiée. Des microcanaux de dimensions 200 μm × 20 μm (L × H) et d'une longueur de 3, 6 μm ont été utilisés. Le microcanal entre les réservoirs avec des seringues montées aux extrémités a été utilisé. Pour rendre le canal plus visible, des colorants alimentaires ont été utilisés.

Regroupez les interconnexions et les fixations aux murs. Vidéo prise au microscope à contraste de phase. Des images de microscopie à contraste de phase et des dessins accompagnent chaque image pour la présentation. (A) La connexion entre deux fils par mouvement en spirale pour résister à l'écoulement (flèche rouge). (B) Fixation entre les faisceaux et la paroi du canal (flèche rouge) ; en même temps, ils sont connectés à deux autres faisceaux (flèche jaune). (C) Les faisceaux de sperme à l'intérieur du canal microfluidique commencent à être connectés (flèches rouges) les uns aux autres, créant un filet de faisceaux de sperme. (D) La formation d'un réseau de faisceaux de sperme.

Lorsqu'une goutte de sperme dilué a été chargée sur le dispositif microfluidique et qu'un flux a été généré, on a remarqué que les faisceaux de sperme se déplaçaient dans le sens contraire du flux. Les faisceaux se rapprochent des parois des microcanaux, et les têtes libres de la partie initiale du faisceau y adhèrent étroitement (Vidéo 5). Ils adhèrent également à toutes les particules stationnaires telles que les débris sur leur chemin pour tenter de résister à la dérive avec le courant. Avec le temps, ces faisceaux sont de longs fils qui attrapent d'autres spermatozoïdes uniques et des faisceaux plus courts (Vidéo 6). Lorsque le flux a commencé à ralentir, les longs fils de sperme ont commencé à former un filet de fils de sperme (Vidéo 7 ; Fig. 2).

À une vitesse d'écoulement élevée (V > 33 µm/s), les mouvements en spirale des fils sont augmentés pour tenter d'attraper de nombreux faisceaux de formation de spermatozoïdes individuels mieux résister à la force de dérive de l'écoulement. Ils tentent également de se fixer à la paroi latérale du microcanal.

Les faisceaux de spermatozoïdes ont été identifiés à l'aide de la microscopie optique (LM) comme une accumulation de têtes de spermatozoïdes et de queues enroulées. Des faisceaux de spermatozoïdes d'agrégations différentes ont également été identifiés, comme des têtes tordues et des agrégats du flagelle, comme des queues collées de plusieurs spermatozoïdes, comme ayant la tête du sperme attachée à la queue, comme ayant la tête du sperme avec un noyau courbé, comme plusieurs queues de spermatozoïdes collées, et sous forme de têtes de spermatozoïdes collées ensemble par une substance d'agglutination en utilisant la microscopie électronique à transmission (MET). La microscopie électronique à balayage (SEM) a révélé un faisceau de spermatozoïdes sous la forme d'un agrégat de têtes de spermatozoïdes recouvertes d'un manteau, les agrégations de spermatozoïdes affichant un réseau de queues enveloppées attachées.

La morphologie et l'ultrastructure du sperme, ainsi que la formation de faisceaux, ont été étudiées à l'aide d'un microscope optique (coupe semi-mince), d'une microscopie électronique à balayage (SEM) et d'une microscopie électronique à transmission (TEM), et les frottis de sperme ont été colorés avec orange d'acridine et examinés par microscopie à épifluorescence.

Les têtes de spermatozoïdes adhèrent ensemble et sont recouvertes de matériel sécrétoire, comme le montre la coloration à l'orange d'acridine des frottis de sperme (Fig. 3B), ce qui entraîne la formation de gros faisceaux (Fig. 3D). Les faisceaux de spermatozoïdes consistaient en des agrégations de spermatozoïdes présentant un réseau de queues collées (Fig. 4A – C). Le faisceau de spermatozoïdes était constitué de queues enveloppées collées de plusieurs spermatozoïdes (Fig. 4D). Une sécrétion (Fig. 4E,F) recouvre les têtes spermatiques du faisceau.

Formation de faisceaux de spermatozoïdes à l'aide d'un microscope à contraste de phase et d'un frottis de sperme coloré à l'acridine orange montrant que la tête du sperme se colle. (A) La formation précoce des faisceaux de spermatozoïdes a commencé avec des spermatozoïdes (cercle blanc) et trois spermatozoïdes (cercle jaune), et la spirale a commencé à la queue et enfin à la tête. (B) Micrographie d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine montrant que la tête de sperme collait ensemble (flèches). La sécrétion recouvre les têtes (S). Grossissement ×1000. (C) Le développement de gros faisceaux transportés à travers le flux dans le canal micro fluide (à l'aide d'une caméra haute vitesse à 950 images/s). (D) Micrographie de frottis de sperme teintée à l'orange d'acridine montrant la formation de gros faisceaux (flèches). Grossissement : ×200.

Images au microscope électronique à balayage de paquets de sperme et d'un frottis de sperme coloré à l'orange d'acridine. (A, B, D, E) sont des micrographies électroniques à balayage colorées numériquement de sperme, tandis que C et F sont des micrographies de frottis de sperme colorés à l'orange d'acridine et montrant un réseau de queues enveloppées adhérentes de plusieurs spermatozoïdes. (A–C) Agrégations de spermatozoïdes représentées par un réseau de queues collées (pointes de flèches). (D) Plusieurs spermatozoïdes de queues enveloppées adhérentes (avec la substance agglutinante, contour rose, flèches). (E et F) Agrégats de tête de sperme (flèches) recouverts d'un matériau agglutinant (têtes de flèches). Les spermatozoïdes formaient des faisceaux avec quelques structures en forme de torsion (F). Grossissement de (C) ×400 et (F) ×200.

En utilisant la microscopie électronique à transmission, nous avons montré que les faisceaux de sperme avaient des queues collées (Fig. 6A, C), avec les têtes collées à la queue (Fig. 6B) ou les têtes étant attachées aux queues (Fig. 6D). La tête du sperme dans le faisceau était pliée, présentant deux sections du noyau dans la section coupée (Fig. 6D). Dans le faisceau de la section coupée, les spermatozoïdes avaient des têtes tordues avec deux sections du noyau et de multiples portions du flagelle (Fig. 5A).

Micrographies électroniques à transmission de couleur numérique démontrant les queues connectées dans un faisceau de sperme et le matériel d'agglutination reliant les têtes de sperme. (A) Queues de spermatozoïdes adhérentes de nombreux spermatozoïdes. Notez comment la queue apparaît dans les vues longitudinales (flèches) et transversales (pointes de flèches). (B) La tête du spermatozoïde (pointe de flèche) est liée à la queue (flèche). (C) Plusieurs queues de spermatozoïdes attachées (pointes de flèches). (D) Le matériel d'agglutination (AS, couleur bleue) relie quatre têtes de spermatozoïdes (couleur violette).

La microscopie électronique à balayage a été utilisée pour détecter les têtes de spermatozoïdes dans le faisceau recouvert d'une sécrétion ou d'un manteau (Fig. 6B), ce qui a révélé que les faisceaux de spermatozoïdes étaient retenus par des substances extracellulaires. La substance agglutinante avait été concentrée au niveau des têtes de spermatozoïdes (assemblage en forme de tête de méduse; Fig. 5B) et étendue distalement, avec un aspect jaune brillant au microscope à fluorescence lorsqu'elle était colorée avec de l'orange d'acridine (Fig. 6C). Cette substance est clairement visible au microscope à balayage et est considérée comme la matière agglutinante. Des coupes semi-minces (Fig. 5C) et des frottis de sperme colorés à l'acridine orange ont révélé que le paquet de sperme contenait des têtes serrées et des queues enroulées (Fig. 5D).

Diverses micrographies montrant l'agrégation de la tête de sperme et de la queue enveloppée à l'aide de diverses méthodes. (A) Une micrographie électronique à transmission colorée numériquement d'un faisceau de spermatozoïdes dans une coupe montre des têtes de spermatozoïdes torsadées ayant deux parties du noyau (couleur bleue) et plusieurs potions du flagelle (couleur verte). (B) Micrographie électronique à balayage de couleur numérique montrant un groupe de têtes de spermatozoïdes ressemblant à des méduses qui semblaient être enduites (flèches). (C) Sections semi-minces montrant l'agrégation des têtes de spermatozoïdes (flèches) et les queues enveloppées (pointes de flèches). (D) La micrographie de frottis de sperme teintée à l'orange d'acridine montre des agrégats de têtes de sperme (flèches) et de queues adhérentes enveloppées (têtes de flèches). A noter que la substance adhésive (S) recouvrait la tête du spermatozoïde. Grossissement de (D) ×1000.

À l'aide d'un microscope électronique à transmission (Fig. 7A), il a également été noté que la tête du sperme était tordue et que le noyau ressemblait à une forme hélicoïdale, ce qui était soutenu par des frottis de sperme colorés à l'acridine orange et étudiés au microscope à fluorescence (Fig. 7B ).

(A) Micrographie électronique à transmission colorée numérique et (B) frottis de sperme teinté d'orange d'acridine montrant des têtes tordues et l'attachement des têtes et des queues de sperme (flèche). Grossissement de (B) ×1000.

La découverte que les spermatozoïdes de Sharkasi s'agglutinent, formant des faisceaux filiformes mobiles, est intéressante. Les propriétés de ces faisceaux donnent un aperçu du rôle qu'ils peuvent jouer dans l'absorption et le stockage des spermatozoïdes dans les SST.

Après l'accouplement, les spermatozoïdes sont déposés dans le vagin et subissent un processus de sélection intense résultant en un nombre limité de spermatozoïdes entrant dans les SST15,16. À ce jour, le mécanisme par lequel les spermatozoïdes entrent et évacuent les SST est inconnu. Chez les volailles domestiques, les spermatozoïdes sont maintenus à l'intérieur des SST pour des durées prolongées allant de 2 à 10 semaines selon les espèces6. La controverse demeure quant à l'état du sperme lors de son stockage à l'intérieur des SST ; sont-ils en mouvement ou inactifs ? En d'autres termes, comment les spermatozoïdes maintiennent-ils leur position à l'intérieur des SST pendant de longues périodes ?

Forman4 a proposé que la résidence et la sortie des spermatozoïdes de la SST peuvent être expliquées sur la base de la motilité des spermatozoïdes. L'auteur a suggéré que les spermatozoïdes maintiennent leur position en nageant contre un courant de fluide généré par les cellules épithéliales SST et que les spermatozoïdes sortent du SST lorsque leur vitesse tombe en dessous d'un point auquel le mouvement de retrait commence en raison d'un manque d'énergie. Zaniboni5 a confirmé la présence des aquaporines 2, 3 et 9 dans la partie apicale des cellules épithéliales des SST, ce qui peut indirectement soutenir le modèle de stockage du sperme de Forman. Dans la présente étude, nous avons constaté que près de la moitié des spermatozoïdes de Sharkasi présentent une rhéotaxie positive en présence d'un fluide en circulation et que les faisceaux de spermatozoïdes agglutinés augmentent le nombre de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive, bien que l'agglutination ralentisse leur vitesse. La façon dont les spermatozoïdes montent vers l'oviducte chez les oiseaux pour atteindre le site de fécondation n'est pas entièrement comprise. Chez les mammifères, le liquide folliculaire chimioattire les spermatozoïdes7. Cependant, on pense que les chimio-attracteurs guident le sperme à une distance proche7. Par conséquent, d'autres mécanismes sont responsables du transport des spermatozoïdes. La capacité des spermatozoïdes à s'orienter et à nager à contre-courant du liquide oviductal sécrété après la copulation a été signalée comme étant un facteur majeur responsable du guidage des spermatozoïdes chez la souris7. Parker17 a supposé que les spermatozoïdes traversent l'oviducte en nageant à contre-courant du courant ciliaire chez les oiseaux et les reptiles. Bien que cela n'ait pas été prouvé expérimentalement in vivo pour les oiseaux, Adolphi18 a été le premier à observer que les spermatozoïdes aviaires présentent une rhéotaxie positive lorsqu'un courant lent est généré dans une fine couche de fluide contenue entre une lamelle et une lame de verre à l'aide d'une bande de papier filtre. Hino et Yanagimachi19 ont installé un complexe ovaires-oviducte-utérus de souris dans un collier de perfusion et ont injecté 1 µl d'encre de Chine dans l'isthme pour visualiser l'écoulement du fluide à l'intérieur de l'oviducte. Ils ont noté un mouvement de contraction et de relaxation très actif dans l'oviducte dans lequel tous les bols d'encre se déplaçaient régulièrement vers l'ampoule de l'oviducte. Les auteurs ont souligné l'importance de l'écoulement du liquide de l'oviducte des parties inférieures vers les parties supérieures de l'oviducte pour l'ascension et la fécondation des spermatozoïdes. Chez les poules et les dindes, Brillard20 rapporte que la migration des spermatozoïdes, de l'entrée du vagin où ils sont déposés jusqu'à la jonction utéro-vaginale où ils sont stockés, s'effectue grâce à leur motilité active. Cependant, cette motilité n'est pas nécessaire entre la jonction utéro-vaginale et l'infundibulum car les spermatozoïdes sont transportés par déplacement passif. Avec la connaissance de ces suggestions précédentes et des résultats obtenus dans la présente étude, on peut supposer que la capacité des spermatozoïdes à se déplacer à contre-courant (rhéotaxie) est l'un des attributs sur la base desquels se déroule le processus de sélection. Et cela détermine le passage des spermatozoïdes à travers le vagin et leur arrivée dans les SST pour le stockage. Cela peut également contribuer au processus de pénétration des spermatozoïdes dans les SST et à leur résidence pendant une certaine période, puis à leur sortie lorsque leur vitesse commence à ralentir, comme Forman4 l'a supposé.

D'autre part, Matsuzaki et Sasanami21 ont suggéré que les spermatozoïdes aviaires subissent des changements de motilité de repos à motilité dans les voies reproductrices mâles et femelles. La suppression de la motilité résidente des spermatozoïdes dans les SST a été proposée pour expliquer le stockage prolongé du sperme, qui est suivi d'une restauration de la motilité après la libération des SST21. Dans des conditions hypoxiques, Matsuzaki et al.1 ont signalé une production et une libération élevées d'acide lactique dans les SST, ce qui peut entraîner la suppression de la motilité résidente des spermatozoïdes. Dans ce cas, l'importance de la rhéotaxie des spermatozoïdes se manifeste lors de la sélection et de l'absorption des spermatozoïdes, mais pas lors du stockage.

Le mode d'agglutination des spermatozoïdes a été suggéré comme une élucidation plausible de la période de stockage prolongée des spermatozoïdes dans les SST, car il s'agit du schéma de résidence des spermatozoïdes courant chez les oiseaux domestiques2,22,23. Bakst et al.2 ont observé que la plupart des spermatozoïdes adhèrent les uns aux autres, formant des agglutinations en forme de faisceaux, et que des spermatozoïdes solitaires sont rarement observés dans les SST des cailles. D'autre part, Wen et al.24 ont observé plus de sperme dispersé et moins de faisceaux de sperme dans la lumière des SST chez les poulets. A partir de ces observations, on peut supposer que la tendance des spermatozoïdes à s'agglutiner diffère entre les espèces aviaires et entre les spermatozoïdes d'un même éjaculat. De plus, Van Krey et al.9 ont suggéré que la dissociation aléatoire des spermatozoïdes agglutinés est responsable de la sortie progressive des spermatozoïdes dans la lumière de l'oviducte. Selon cette hypothèse, les spermatozoïdes ayant moins de capacité d'agglutination devraient d'abord sortir des SST. Dans ce cas, la capacité des spermatozoïdes à s'agglutiner pourrait être un facteur influençant les résultats de la compétition des spermatozoïdes chez les oiseaux en promiscuité. De plus, plus la période de dissociation des spermatozoïdes agglutinés est longue, plus la durée de la fertilité sera longue.

Même si des agrégations de spermatozoïdes et leur adhésion en faisceaux ont été observées dans plusieurs études2,22,24, elles n'ont pas encore été décrites en détail en raison de la difficulté de les observer cinématiquement à l'intérieur des SST. Peu de tentatives ont été faites pour étudier les agglutinations de sperme in vitro. Des agrégations étendues mais transitoires ont été observées lorsqu'un fil délicat a été retiré à travers une goutte de sperme pendante. Cela a provoqué la projection d'une vésicule allongée à partir de la goutte, simulant une glande spermatique. En raison des limitations tridimensionnelles et du court temps de séchage de la goutte, l'ensemble s'est rapidement détérioré9. Dans l'étude actuelle utilisant des poulets Sharkasi et une puce microfluidique, nous avons pu décrire comment ces faisceaux se forment et comment ils se déplacent en détail. Les faisceaux de spermatozoïdes se forment dès que le sperme a été collecté et se sont avérés nager dans un mouvement en spirale et montrer une rhéotaxie positive lorsqu'ils sont présents dans un flux. De plus, il a été observé que les faisceaux de spermatozoïdes augmentent la linéarité de la motilité par rapport aux spermatozoïdes solitaires lorsqu'ils sont observés macroscopiquement. Cela indique que l'agglutination des spermatozoïdes peut se produire avant la pénétration de la SST et que leur formation n'est pas susceptible d'être confinée dans une petite zone en raison de la pression comme suggéré précédemment (Tingari et Lake12). Pendant la formation du faisceau de spermatozoïdes, les spermatozoïdes nagent de manière synchrone jusqu'à ce qu'ils forment des sites de connexion, puis leurs queues s'enroulent les unes autour des autres et les têtes de spermatozoïdes restent libres, mais les queues et les spermatozoïdes distaux sont collés ensemble par une substance adhésive. Par conséquent, les têtes libres du faisceau sont responsables du mouvement en entraînant le reste du faisceau. La microscopie électronique à balayage des faisceaux de spermatozoïdes a révélé des têtes de spermatozoïdes adhérentes recouvertes d'une substance adhésive abondante, indiquant que les têtes de spermatozoïdes se fixent dans des faisceaux fixes qui peuvent se produire après avoir atteint le site de stockage (SST).

Lorsque les frottis de sperme sont teints avec de l'orange d'acridine, la substance adhésive extracellulaire entourant le sperme est visible au microscope à fluorescence. Cette substance permet aux faisceaux de sperme de coller à toute surface ou particule environnante et de s'y accrocher afin qu'ils ne dérivent pas avec les courants environnants. Par conséquent, nos observations ont mis en lumière le rôle joué par l'adhérence des spermatozoïdes sous la forme de faisceaux mobiles. Leur capacité à nager à contre-courant, ainsi que leur capacité à coller aux surfaces adjacentes maintiennent la résidence des spermatozoïdes pendant une période prolongée à l'intérieur des SST.

Rothschild25 a utilisé une chambre d'hémocytomètre pour examiner la distribution de nage des spermatozoïdes de taureau dans une goutte de suspension en prenant des micrographies à travers la chambre lorsque l'axe optique du microscope était vertical et horizontal. Les résultats ont montré que les spermatozoïdes sont attirés par les surfaces de la chambre. Les auteurs ont suggéré qu'il pourrait y avoir des interactions hydrodynamiques entre le sperme et les surfaces. Tenir compte de cela, ainsi que de la capacité du sperme de poulet Sharkasi à former des faisceaux collants, peut augmenter la possibilité que le sperme adhère aux parois du SST et soit stocké pendant une durée prolongée.

Baccetti et Afzeliu26 ont rapporté que le glycocalyx des spermatozoïdes est essentiel pour la reconnaissance et l'agglutination des gamètes. Forman10 a observé que l'hydrolyse des liaisons α-glycosidiques dans le revêtement glycoprotéine-glycolipide en traitant les spermatozoïdes de volaille avec de la neuraminidase entraînait une diminution de la fertilité sans affecter la vitalité des spermatozoïdes. Les auteurs ont émis l'hypothèse que la manipulation du glycocalyx par la neuraminidase perturbait la séquestration des spermatozoïdes dans la jonction utéro-vaginale, ce qui diminuait par conséquent la fertilité. Leurs observations ne pouvaient pas écarter la possibilité que le traitement à la neuraminidase puisse avoir réduit la reconnaissance des ovocytes de sperme. Forman et Engel10 ont découvert que les taux de fertilité diminuaient lorsque les poules étaient inséminées par voie vaginale avec des spermatozoïdes traités à la neuraminidase. Cependant, l'insémination intramagnale avec des spermatozoïdes traités à la neuraminidase n'a eu aucun effet sur la fertilité par rapport aux oiseaux témoins. Les auteurs ont conclu que les altérations de la couverture glycoprotéine-glycolipide entourant la membrane spermatique réduisent la capacité de fécondation du sperme en perturbant la séquestration des spermatozoïdes dans la jonction utéro-vaginale, ce qui à son tour augmente la vitesse à laquelle les spermatozoïdes sont perdus de la jonction utéro-vaginale, mais ne n'affecte pas la reconnaissance des spermatozoïdes et des ovocytes.

Chez les dindes, Bakst et Bauchan11 ont trouvé de petites vésicules et des fragments de membrane dans la lumière des SST et ont observé que certaines de ces particules étaient fusionnées avec la membrane du sperme. Les auteurs ont émis l'hypothèse que ces interconnexions pourraient contribuer au stockage prolongé du sperme dans les SST. Cependant, les chercheurs n'ont pas précisé la source de ces particules, si elles sont sécrétées par les cellules épithéliales des SST, produites et sécrétées par le système reproducteur masculin, ou par les spermatozoïdes eux-mêmes. Aussi, si ces particules sont responsables de l'agglutination. Grützner et al.27 ont rapporté que les cellules épithéliales de l'épididyme produisent et sécrètent une ou plusieurs protéines spécifiques nécessaires à la formation de faisceaux de spermatozoïdes chez les monotrèmes. Les auteurs ont également signalé que la dispersion de ces faisceaux dépend des interactions des protéines épididymaires. Nixon et al.28 ont découvert que l'épididyme sécrétait une protéine, l'ostéonectine acide riche en cystéine; SPARC, est impliqué dans la formation de faisceaux de spermatozoïdes chez les échidnés à bec court et les ornithorynques. La dispersion de ces faisceaux étant associée à la perte de cette protéine.

Dans la présente étude, l'analyse de l'ultrastructure par microscopie électronique a révélé que les spermatozoïdes adhéraient à de grandes quantités de substances denses. On pense que ces substances sont responsables de l'agglutination, et elles sont condensées entre et autour des têtes collées, mais se trouvent à une concentration plus faible dans la région de la queue. Nous suggérons que cette substance agglutinante est sécrétée par le système reproducteur masculin (épididyme ou canal déférent) avec le sperme car nous avons fréquemment observé que les spermatozoïdes sont séquestrés du liquide lymphatique et du plasma séminal au moment de l'éjaculation. Il a été rapporté que lorsque les spermatozoïdes de volaille traversent l'épididyme et le canal déférent, ils subissent des changements de maturation soutenant leur capacité à se lier aux protéines et à acquérir des glycoprotéines associées aux lemmes plasmatiques29,30. Ces protéines persistent sur les membranes des spermatozoïdes résidents dans les SST suggérant que ces protéines peuvent influencer l'acquisition de la stabilité membranaire des spermatozoïdes30 et déterminer leur capacité fécondante31. Ahammad et al.32 ont rapporté que les spermatozoïdes obtenus à partir de différentes parties du système reproducteur masculin (des testicules au canal déférent distal) affichaient des taux de survie progressivement croissants dans des conditions de stockage liquide, quelle que soit la température de stockage, ainsi qu'une capacité croissante à survivre dans la poule oviducte après insémination artificielle.

Les faisceaux de sperme de poulet Sharkasi ont des caractéristiques et des fonctions différentes de celles découvertes chez d'autres espèces, telles que l'échidné, l'ornithorynque, la souris des bois, la souris sylvestre et le cobaye. Chez les poulets Sharkasi, la formation de faisceaux de sperme diminue sa vitesse de nage par rapport au sperme individuel. Cependant, ces faisceaux augmentent le pourcentage de spermatozoïdes présentant une rhéotaxie positive et améliorent la capacité des spermatozoïdes à se stabiliser dans un environnement dynamique. Par conséquent, nos résultats renforcent les suggestions précédentes selon lesquelles l'agglutination des spermatozoïdes dans les SST est associée à une durée prolongée de stockage des spermatozoïdes. Nous supposons également que la tendance des spermatozoïdes à former des faisceaux peut contrôler le taux de perte de spermatozoïdes des SST, ce qui, par conséquent, peut modifier les résultats de la compétition des spermatozoïdes. Selon cette spéculation, les spermatozoïdes à faible capacité d'agglutination évacuent les SST en premier, tandis que les mâles possédant des spermatozoïdes à forte capacité d'agglutination génèrent la majeure partie de la progéniture. La formation de faisceaux de spermatozoïdes chez les monotrèmes est avantageuse et affecte les proportions de paternité mais en utilisant un mécanisme différent. Chez l'échidné et l'ornithorynque, les spermatozoïdes sont disposés parallèlement les uns aux autres pour augmenter la vitesse d'avancement du faisceau28. La motilité du faisceau chez l'échidné est environ trois fois plus rapide que celle du sperme solitaire27. La formation de tels faisceaux de sperme chez l'échidné est considérée comme une adaptation évolutive pour affirmer la domination car les femelles sont promiscuité et s'accouplent généralement avec plusieurs mâles. Par conséquent, les spermatozoïdes des différents éjaculats sont en forte compétition pour féconder les ovules33.

Les faisceaux de sperme agglutinés chez les poulets Sharkasi sont facilement observés à l'aide d'un microscope à contraste de phase, ce qui est considéré comme avantageux car il permet une étude facile du comportement des spermatozoïdes in vitro. Le mécanisme par lequel la formation de faisceaux de spermatozoïdes profite à la reproduction chez les poulets Sharkasi diffère également de celui observé chez certains mammifères euthériens représentant un comportement coopératif des spermatozoïdes, comme les souris des bois, où certains spermatozoïdes montrent un comportement altruiste en aidant d'autres individus apparentés à atteindre l'ovule et à compromettre leur propre capacité de fertilisation34. Un autre exemple de comportement coopératif des spermatozoïdes est découvert chez les souris sylvestres, où les spermatozoïdes sont capables de reconnaître et de s'agréger avec les spermatozoïdes les plus génétiquement apparentés et de former des groupes coopératifs pour augmenter leur vitesse contre des spermatozoïdes non apparentés35.

Les résultats obtenus dans cette étude ne contredisent pas la théorie de Foman pour expliquer le stockage à long terme du sperme au sein des SST. Le chercheur a rapporté que les spermatozoïdes passent de longues périodes de temps en mouvement constant contre un flux de cellules épithéliales tapissant les SST et qu'après un certain temps, le réservoir d'énergie des spermatozoïdes s'épuise et, par conséquent, la vitesse diminue, permettant le drainage des cellules à faible énergie. spermatozoïdes avec le liquide qui s'écoule de la lumière des SST dans la lumière de l'oviducte. Nous avons observé dans l'étude actuelle que la moitié des spermatozoïdes solitaires affichent la capacité de nager contre le fluide qui s'écoule et que leur adhérence en faisceaux augmente leur capacité à montrer une rhéotaxie positive. De plus, nos résultats ne contredisent pas ceux de Matsuzaki et al.1 qui ont rapporté une augmentation de la sécrétion d'acide lactique dans les SST qui peut supprimer la motilité des spermatozoïdes résidents. Cependant, nos résultats décrivent la formation des faisceaux de spermatozoïdes mobiles et leur comportement rhéotactique lorsqu'ils sont présents dans un environnement dynamique à l'intérieur de micro-canaux comme une tentative d'élucider leur comportement dans les SST. Les recherches futures se concentreront probablement sur l'identification de la composition chimique et de la source du matériau agglutinant, ce qui aidera sans aucun doute les chercheurs à concevoir de nouvelles méthodes pour stocker le sperme liquide et augmenter la durée de la fertilité.

Quinze coqs Sharkasi à cou nu âgés de trente semaines (homozygote dominant; Na Na) ont été sélectionnés et utilisés comme donneurs de sperme dans l'étude. Les oiseaux ont été élevés à la Ferme avicole de recherche, Faculté d'agriculture, Université d'Assiout, Gouvernorat d'Assiout, Égypte. Les oiseaux ont été logés dans des cages individuelles (30 × 40 × 40 cm), exposés à un programme d'éclairage (16 h de lumière : 8 h d'obscurité), et nourris avec un régime commercial contenant 160 g de protéines brutes, 2800 kcal d'énergie métabolisable, 35 g de calcium, et 5 g de phosphore assimilable par kg de régime alimentaire.

La méthode de massage abdominal a été utilisée pour prélever la semence des coqs selon36,37. Au total, 45 échantillons de sperme ont été prélevés sur une période de 3 jours chez les 15 mâles. Les éjaculats (n = 15/jour) ont été immédiatement dilués avec un diluant de sperme de volaille Beltsville 1:1 (v:v) comprenant du diphosphate de potassium (1,27 g), du glutamate de sodium monohydraté (0,867 g), du fructose (0,5 g), de l'acétate de sodium anhydre ( 0,43 g), Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane (0,195 g), citrate de potassium monohydraté (0,064 g), monophosphate de potassium (0,065 g), chlorure de magnésium (0,034 g) et H2O (100 ml); pH = 7,5 et osmolalité 333 mOsm/kg38. Les échantillons de sperme dilué ont d'abord été examinés au microscope optique pour garantir la bonne qualité du sperme (motilité vigoureuse), puis conservés dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à leur utilisation dans la demi-heure suivant le prélèvement.

La cinématique et la rhéotaxie des spermatozoïdes ont été décrites à l'aide du système de dispositif microfluidique. Les échantillons de sperme ont ensuite été dilués à 1:40 dans un prolongateur de sperme de volaille de Beltsville et ont été chargés dans le dispositif microfluidique (voir ci-dessous), et les paramètres cinétiques ont été déterminés par un système d'analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA)39 qui a été précédemment développé pour la caractérisation. du mouvement des spermatozoïdes dans des environnements microfluidiques (Département de génie mécanique, Faculté d'ingénierie, Université d'Assiut, Égypte). Le plugin peut être téléchargé à partir de l'URL : http://www.assiutmicrofluidics.com/research/casa39. La vitesse curviligne (VCL, µm/s), la vitesse en ligne droite (VSL, µm/s) et la vitesse de trajectoire moyenne (VAP, µm/s) ont été mesurées. Des vidéos de spermatozoïdes ont été prises avec un microscope inversé Optika XDS-3 à contraste de phase (objectifs 40×) couplé à une caméra Tucson ISH1000 à 30 images/s pendant 3 s. Un minimum de trois champs et 500 traces de sperme ont été examinés par échantillon à l'aide du logiciel CASA. Les vidéos enregistrées ont été traitées à l'aide d'un CASA développé à domicile. La définition de la motilité dans le plugin CASA est basée sur la vitesse de nage des spermatozoïdes par rapport à la vitesse d'écoulement sans inclure d'autres paramètres, tels que le mouvement latéral, car cela s'est avéré plus fiable dans l'écoulement des fluides. Le mouvement rhéotactique a été décrit comme des spermatozoïdes nageant dans le sens contraire de l'écoulement du fluide. Les spermatozoïdes présentant une rhéotaxie ont été divisés par le nombre de spermatozoïdes mobiles ; avec des spermatozoïdes statiques et ceux balayés par un flux convectif, ont été retirés du décompte.

Tous les produits chimiques utilisés ont été obtenus auprès d'Elgomhoria Pharmaceuticals (Le Caire, Égypte), sauf indication contraire. Le dispositif a été fabriqué comme décrit par El-sherry et al.40, avec quelques modifications. Les matériaux pour la fabrication de microcanaux comprenaient des tranches de verre (Howard Glass, Worcester, MA), du résist négatif SU-8-25 (MicroChem, Newton, CA), de l'alcool diacétonique (Sigma Aldrich, Steinheim, Allemagne) et du polydiméthylsiloxane PDMS (Syllgard-184, Dow Corning, Midland, MI). Les microcanaux ont été fabriqués par lithographie douce41. Tout d'abord, un masque de transparence portant la conception de microcanaux requise a été imprimé à l'aide d'une imprimante haute résolution (Prismatic, Cairo, Egypt and Pacific Arts and Design, Markham, ON). Les masters ont été préparés en utilisant des tranches de verre comme substrat. Les tranches ont été nettoyées dans de l'acétone, de l'alcool isopropylique et de l'eau désionisée, puis recouvertes d'une couche de SU8-25 de 20 µm d'épaisseur par centrifugation (3000 tr/min, 1 min). La couche SU-8 a ensuite été cuite doucement (65 ° C, 2 min et 95 ° C, 10 min) et exposée à la lumière UV pendant 50 s. Une cuisson post-exposition a été effectuée à 65 ° C pendant 1 min et à 95 ° C pendant 4 min pour réticuler la couche de SU-8 exposée, qui a ensuite été développée dans du diacétone alcool pendant 6,5 min. Les tranches ont été cuites au four (200 ° C pendant 15 min) pour durcir davantage la couche de SU-8.

Le PDMS a été préparé en mélangeant le monomère et l'agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 en poids, puis dégazé dans un dessiccateur à vide et versé sur le maître SU-8. Le PDMS a été durci dans un four (120 ° C, 30 min), et les canaux ont ensuite été coupés, décollés du maître et perforés pour permettre des connexions de tubes à l'entrée et à la sortie des microcanaux. Enfin, un traitement corona portable (Electro-Technic Products, Chicago, IL) a été utilisé pour lier de manière permanente les microcanaux PDMS à une lame de verre de microscope, comme décrit ailleurs42. Les dimensions des microcanaux utilisés dans la présente étude étaient de 200 µm × 20 µm (L × H) et 3,6 cm de long.

L'écoulement de liquide induit par la pression hydrostatique à l'intérieur du microcanal a été obtenu en maintenant le niveau de liquide au réservoir d'entrée plus élevé qu'au réservoir de sortie avec une différence de hauteur Δh39 (Fig. 1).

La vitesse moyenne à l'intérieur du microcanal peut alors être calculée à l'aide de l'équation de Darcy-Weisbach,

où f est le facteur de frottement défini comme f = C/Re pour un écoulement laminaire dans un conduit rectangulaire, où C est une constante dépendant du rapport d'aspect du canal, L est la longueur du microcanal, Vav est la vitesse moyenne à l'intérieur du microcanal, Dh est la diamètre hydraulique du canal, et g est l'accélération gravitationnelle. À l'aide de cette équation, la vitesse moyenne à l'intérieur du canal peut être calculée à l'aide de l'équation suivante :

Un profil de vitesse se forme dans tout un canal et a été calculé à l'aide de l'équation suivante pour les canaux avec un rapport d'aspect inférieur à 0,5.

où V est la vitesse du liquide à n'importe quel endroit du canal, Vav est la vitesse moyenne du liquide, a est la largeur du canal, b est la hauteur du canal, y et z sont les deux coordonnées mesurées à partir de l'axe du canal le long de la hauteur et de la largeur du canal respectivement, et m et n sont deux facteurs numériques calculés selon

La génération de flux hydrostatique est une méthode simple et peu coûteuse pour générer un flux à l'intérieur des microcanaux et ne souffre pas du flux pulsé typique des pompes à seringue43. La vitesse moyenne à l'intérieur du microcanal peut être calculée à l'aide de l'équation de Darcy-Weisbach44. Le profil de vitesse à l'intérieur du canal a été calculé pour les canaux avec un rapport d'aspect inférieur à 0,545. La vitesse moyenne du liquide a été maintenue à 33 ± 5 µm/s.

Après la collecte et la dilution du sperme, des échantillons (n = 6) ont été conservés dans un fixateur de Karnovsky46 (tableau 1) et deux aliquotes ont été faites pour chaque échantillon pour l'analyse par microscopie électronique à balayage et la fabrication de résine de coupes semi-minces et ultra-minces. D'autres tubes contenant des échantillons non fixés ont été utilisés pour préparer des frottis pour la coloration à l'orange d'acridine. Les frottis de sperme ont été colorés par la coloration à l'acridine orange, un colorant cationique qui colore les vésicules membranaires contenant des protéines telles que les vésicules sécrétoires, les compartiments acides liés à la membrane et les lysosomes acides. L'acridine orange subit une réaction métachromatique qui est liée à la libération de fluorescence verte et rouge. L'acridine orange réagit avec les vésicules liées à la membrane, les faisant se colorer en orange ou en rouge. L'acridine orange est utilisée pour détecter les vésicules de sécrétion et les lysosomes47,48,49,50.

Composants de la tache Eau distillée, orange d'acridine, acide acétique glacial.

Préparation des réactifs Une solution mère de 50 mg d'orange d'acridine a été préparée dans 10 ml d'eau distillée et conservée au réfrigérateur. Pour faire une solution de travail, il a été combiné avec 1 ml de solution mère d'acridine orange et 0,5 ml d'acide acétique glacial dans 50 ml d'eau distillée.

Méthode de coloration Un frottis est réalisé sur une lame propre, puis séché à l'air. Après cela, la lame a été fixée avec du méthanol et de nouveau séchée à l'air. Il est ensuite placé dans un bac contenant une solution de travail de coloration à l'acridine orange (c'est-à-dire 0,01 %) pendant 20 min. Les lames ont été délicatement lavées et séchées avant d'être analysées à l'aide d'un microscope (modèle Letiz DM 2500) avec des unités fluorescentes externes (Leica EL 6000).

Après deux gouttes de sperme dilué ont été fixées dans un fixateur Karnovsky pendant 2 h à 4 ° C, puis traitées comme indiqué par51. Fixation appliqué un volume équivalent de fixateur de Karnovsky au sperme dilué pendant 2 h à 4 °C.

Les échantillons fixés ont été centrifugés et le culot a été mis en suspension dans du tampon PBS frais. Laver trois fois avec une solution tampon phosphate pH 7-2-7-4 (tableau 1) et centrifugation après chaque lavage

Pendant deux heures à température ambiante, les échantillons ont été centrifugés et post-fixés dans du tétroxyde d'osmium à 10% composé dans un tampon phosphate 0–1 M pH 7-2-7-4 et du chlorure de calcium 2–5 mM.

Les échantillons ont été centrifugés, puis le culot a été mis en suspension et lavé dans de l'alcool éthylique à 50 %. Après une dernière centrifugation, le culot a été soigneusement mélangé dans un petit volume d'alcool à 50%, repris dans une pipette Pasteur et lentement distribué goutte à goutte sur la surface d'une pile de papiers filtres rapides (Whatman 41).

Entre les gouttelettes, le liquide était absorbé par le papier filtre. En conséquence, un « tas » de matériau cellulaire s'est formé à la surface du papier filtre, qui a pu être retiré avec une spatule fine et déposé sur une plaque de gélose à 2–4 %. A 60°C, le matériau est recouvert d'agar fondu.

Suite à l'élimination de l'excédent de gélose entourant l'échantillon, le « bloc » de matériau a été traité de la manière indiquée par52,53 comme suit : déshydraté à l'aide de grades croissants d'éthanol-alcools (70 %, 90 p %, 100 I %, 100 II %) et incrusté dans l'Epon-araldite. Les blocs ont été déshydratés à l'aide d'un mélange d'éthanol et d'oxyde de propylène. Les blocs ont été déshydratés dans des degrés croissants d'éthanol pendant 30 min, 70 min pendant une nuit, 90 min, 100 % I pendant 30 min et 100 % II pendant 60 min.

L'enrobage de résine a été réalisé en utilisant de l'oxyde de propylène (Merck, Darmstadt, Allemagne) pendant 30 min, Epon : oxyde de propylène (rapport d'environ 1:1) pendant 30 min et Epon pendant 3 h. Epon a été généré en combinant 5 ml d'Epon 812 (Polysciences, Eppelheim, Allemagne) avec 5 ml d'Araldite et 12 ml de DDSA.

Epon a été utilisé pour implanter les blocs, qui ont ensuite été incubés à 60 °C. Un mélange Epon et un accélérateur (DMP-30) ont été utilisés pour polymériser les échantillons (1,5%). Les blocs ont été incubés pendant 3 jours aux températures suivantes : 60 °C le premier jour, 70 °C le deuxième jour et 75 °C le troisième jour.

Le bleu de toluidine a été utilisé pour colorer des coupes semi-fines (1 micron) coupées à l'aide d'un ultra-microtome Ultra cut E (Reichert Leica) (tétraborate de sodium [borax] 1 g, bleu de toluidine 1 g et eau distillée 100 ml)54. Les coupes colorées ont été examinées à l'aide d'un microscope Leitz Dialux 100. Les photographies ont été prises avec un appareil photo numérique Canon (Canon Power shot A95).

Nous avons choisi des portions avec des faisceaux de sperme à partir de coupes semi-fines pour faire des coupes ultra-fines. Un Ultrotom® V a été utilisé pour couper des portions ultrafines (LKB Bromma, Munich, Allemagne). Les sections de 70 nm ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb55 et étudiées à l'aide d'un microscope électronique à transmission JEOL100CX II à l'unité de microscopie électronique de l'Université d'Assiut à Assiut, en Égypte.

Le développement des faisceaux de spermatozoïdes a été observé à l'aide d'un microscope électronique à balayage (MEB). La préparation des échantillons a été effectuée conformément à56 comme suit : chaque échantillon a été fixé dans un fixateur de Karnovsky (tableau 2)46 pendant 4 h à 4 °C. Les échantillons ont ensuite été centrifugés et lavés dans le même tampon de fixation (5 fois) avant d'être post-fixés pendant 2 h à température ambiante dans de l'acide osmique à 1 % dans du tampon phosphate de Na 0,1 M. Ils ont été rincés 15 fois avec du tampon Phosphate 0,1 M. Des qualités croissantes d'alcool éthanol avec des concentrations de 50, 70, 90 et 100 % ont été utilisées pour sécher les échantillons (30 min à chaque concentration). Chaque échantillon a été distribué sur un bateau en aluminium, attaché, puis séché à l'air. Enfin, les échantillons ont été recouverts d'or à l'aide d'un dispositif de pulvérisation ionique JEOL1100 E et examinés à KV10 à l'aide d'un microscope électronique à balayage JEOL (JSM5400 LV).

Pour détecter la structure précise, nous avons coloré numériquement les images au microscope électronique à balayage et à transmission dans Photoshop. De nombreux auteurs ont déjà utilisé cette méthodologie55,56,57,58,59,60,61,62.

Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± ET. L'ANOVA de Kruskal-Wallis sur les rangs a été utilisée pour comparer les valeurs moyennes, suivie des comparaisons multiples de Dunn. Toutes les statistiques ont été calculées à l'aide de JMP v5.0.1 (SAS campus drive, Cary, NC, USA) ou du logiciel GraphPad Prism v5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Les différences de P < 0,05 ont été considérées comme significatives.

Nous avons utilisé l'ANOVA de Kruskal-Wallis pour comparer les mouvements des spermatozoïdes isolés et des faisceaux, qui avaient différentes tailles d'échantillon. Cette méthode est utilisée pour comparer deux ou plusieurs échantillons indépendants de tailles d'échantillon égales ou différentes.

Toutes les données créées ou analysées au cours de cette enquête sont incluses dans cet article publié et sont disponibles sur demande auprès des auteurs.

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Ces auteurs ont contribué à parts égales : Taymour M. El-Sherry, Hanan H. Abd-Elhafeez et MAM Sayed.

Département de thériogénologie, Faculté de médecine vétérinaire, Université d'Assiut, Assiut, 71526, Égypte

Taymour M. El-Sherry

Département des cellules et tissus, Faculté de médecine vétérinaire, Université d'Assiut, Assiut, 71526, Égypte

Hanan H.Abd Elhafeez

Département de la production avicole, Faculté d'agriculture, Université d'Assiut, Assiut, 71526, Égypte

MAM a dit

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Le travail a été réparti équitablement entre les auteurs. TME, MAMS, HHA, y compris l'étude de recherche, l'analyse et l'interprétation des données, l'arrangement des images et la rédaction sur papier. Tous les auteurs ont lu et approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance à Hanan H. Abd-Elhafeez.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

El-Sherry, TM, Abd-Elhafeez, HH & Sayed, MAM Nouvelles connaissances sur la rhéotaxie, l'agglutination et la formation de faisceaux de spermatozoïdes chez les poulets Sharkasi sur la base d'une étude in vitro. Sci Rep 12, 13003 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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Reçu : 23 octobre 2021

Accepté : 20 juillet 2022

Publié: 29 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-17037-x

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